Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru

Uvod

Koronavirusi so znani po tem, da so uspešni v izogibanju gostiteljevemu nativnemu imunskemu sistemu. To se kaže v komaj zaznavnem interferonskem odzivu v prvih urah po okužbi, obenem pa je močno olajšana tudi vzpostavitev virusne replikacije. Izogib primarnemu imunskemu sistemu temelji na odstranjevanju dsRNA, ki bi sicer aktivirala citoplazemske gostiteljske senzorje.

Koronavirusna endonukleaza (EndoU) je nestrukturni protein 15 (nsp15), kodiran v odprtem bralnem okvirju ORF1b virusnega genoma. Prvotno je bil nsp15 opredeljen kot sestavi del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, vendar so nadaljnje biokemijske in strukturne študije razkrile encimsko (endonuklezano) aktivnost nsp15. Zadnje raziskave pa kažejo, da EndoU sodeluje pri izogibanju prepoznavanja virusne dvoverižne RNA in s tem preprečevanju aktivacije gostiteljskega imunskega odziva.

Nsp15 kot sestavni del CoV replikaznega poliproteina

Nsp 15 je sestavni del CoV replikaznega poliproteina pp1ab. Pri SARS-CoV-2 nsp15 sestavlja 346 aminokislinskih ostankov, ki se nahajajo na regiji 6453–6798 AK-ostanka. Protein nastane s proteolitično cepitvijo poliproteina s 3C-like proteazo (3CLpro), ki tvori približno 50kDa velik produkt.

Odkrivanje EndoU aktivnosti

Ko je bil CoV potrjen kot etiološki SARS, so raziskovalci začeli intenzivno preučevati genomska zaporedja različnih virusov. S poravnavo genomskih zaporedij 3' terminalne regije nsp15 so ugotovili, da ima CoV EndoU domena zelo podobno zaporedje kot poli(U)- specifična endoribonukleaza iz organizma Xenopus laevis. Iz tega so sklepali, da bi tudi CoV nsp15 lahko imela endoribonukleazno aktivnost.

Do takrat je bila EndoU domena značilna le za viruse iz rodu Nidovirales, v kasnejših raziskavah pa so odkrili, da je slednja prisotna tudi pri članih družine Arteriviridae. Najnovejše raziskave pa so pokazale, da prisotnost domene EndoU ni univerzalna pri vseh nidovirusih. Najdemo jo le pri nidovirusih, ki okužijo vretenčarje, vključno s koronavirusi (CoV) in arterivirusi, medtem ko nidovirusi žuželk in ronivirusi, ki okužijo nevretenčarje, nimajo zapisa za EndoU domeno.

Nsp15 je U-specifična endoribonukleaza

Raziskave EndoU aktivnosti SARS-CoV nsp15 in vitro so potrdile napovedano ribonukleazno aktivnost proteina, saj so pokazale, da slednji lahko cepi le enoverižno (ss) in dvoverižno (ds) RNA, ter nobene izmed DNA molekul. Potrdile so tudi, da je encim endonukleaza in ne eksonukleaza, saj kovalentne modifikacije 5' ali 3' koncev RNA substratov niso vplivale na delovanje encima; nsp 15 je kljub modificiranim koncem še vedno cepil RNA.

Prav tako so biokemijski eksperimenti pokazali, da nsp15 prednostno cepi RNA substrate na 3' koncu uridinov, iz česar izhaja tudi njeno ime EndoU (Uridylate-specific endoribonuclease), ki kaže na njeno specifičnost cepitve. Nsp15 s cepitvijo uravnava dolžino poliuridinov, ki jih najdemo na 5' koncu negativne verige RNA, in tako omogoči virusu, da se izogne aktivaciji imunskega odziva gostitelja.

Strukturne analize pa so pokazale, da je nsp15 v raztopini lahko prisotna bodisi kot monomer ali heksamer, kjer slednji predstavlja aktivno obliko EndoU. Za aktivnost EndoU je torej ključna heksamerizacija nsp15. Poleg tega, nsp15 za aktivno konformacijsko obliko potrebuje kofaktorje, ki jih predstavljajo dvovalentni kovinski ioni (Mn+2).

Struktura nsp15

EndoU je v aktivna le v heksamerni obliki, sestavljata pa jo dva trimera. Monomer, velik 47,9 kDa je razdeljen na N-končno domeno, pomembno za sestavo heksamera, srednjo variabilno domeno in C-končno domeno, na kateri se nahaja katalitično mesto. Ob oligomerizaciji se N-končne domene poravnajo v sredini proteina, kjer oblikujejo negativno nabiti kanal, C-končne domene pa so na zunanji površini proteina. Heksamer je velik 252 kDa. Hkrati je aktivnih vseh 6 aktivnih mest, ker pa se ta nahajajo na zunanji površini proteina in blizu stika posameznih protomerov, lahko predvidevamo, da je aktivnost alosterično kontrolirana. Struktura je zelo podobna strukturi nsp15 mišjega hepatitisa (MHV), razlikujeta se v osrednji domeni, kjer ima MHV nsp15 daljšo povezovalno zanko, na kateri se nahaja signalno zaporedje za pakiranje proteina, tudi brez nje pa je protein funkcionalen. Podobno vlogo kot nsp15 pri koronavirusih ima nsp11 pri arterivirusih, se pa ti po strukturi popolnoma razlikujejo. Nsp11 nima srednje domene, tudi N-končih domen ne moramo poravnati, edina podobnost pa je zgradba aktivnega mesta. Poleg tega nsp11 oblikuje asimetrične oligomere.

Vloga pri replikaciji

Ker se EndoU nahaja ob podvajajoči se RNA, so sprva sklepali, da ima ključno vlogo pri replikaciji. Ob analizi neaktivnih mutantov nsp15, ki so imeli na replikacijo virusa zanemarljiv učinek, so ugotovili, da nanjo ne vpliva direktno, kvečjemu posredno. Mutant, ki je replikacijo CoV 229E v celičnih kulturah popolnoma ustavil, je imel aspartat na mestu 229 zamenjan z alaninom. Do defekta najverjetneje pride zaradi porušitve sekundarne strukture proteina.

Delovanje aktivnega mesta

V aktivnem mestu na C-končni domeni se nahajajo tri aminokisline, ki encimu omogočajo funkcionalnost in specifičnost. Trojica dveh histidinov in lizina je dobro ohranjena med ostalimi koronavirusnimi nsp15, pa tudi med ostalimi celičnimi endoribonukleazami. Zaradi tega lahko predvidimo podoben mehanizem delovanja, kot ga ima RNaza A. Tako bi encim kataliziral dvostopenjsko reakcijo, v kateri najprej tvori ciklični 2'3'-fosfat in ga nato hidrolizira v 3'-fosfat. Pri tem prvi histidin tvori vodikovo vez s fosfatom in sproži transestrifikacijo, drugi histidin deluje kot baza in tvori vodikovo vez z 2'OH skupino in jo s tem aktivira za nukleofilni napad, lizin pa stabilizira deprotonacijo 2'O. V drugem koraku histidina obrneta vloge.

Inhibitorji

Na nsp15 so testirali učinek inhibitorjev znanih za RNazo A, ti pa niso dali enotnih rezultatov. Najbolj obetavne rezultate je pokazala obdelava s Kongo rdečo, kar nakazuje, da bi inhibitorje RNaze A lahko uporabili za uravnavo virusne EndoU aktivnosti v gostitelju.

Nsp15 kot antagonist IFN

Nsp15 SARS-CoV lahko deluje kot antagonist interferonov (IFN), kar pomeni, da zavira signalno pot preko IFN in prepreči aktivacijo naravnega imunskega sistema. Ker je nsp15 del virusnega replikacijsko-transkripcijskega kompleksa, je endoribonukleazna aktivnost močno regulirana med virusno replikacijo.

Endoribonukleazna aktivnost je ključna za izogibanje gostiteljevim senzorjem. Koronavirusi, ki so mutirani tako, da nimajo endoribonukleazne aktivnosti, se imunskemu odzivu ne uspejo izogniti. Okužba celic s tako mutiranimi virusi stimulira makrofage, ki izhajajo iz kostnega mozga (BMDM). Ti makrofagi proizvedejo veliko količino IFN v primerjavi z divjim tipom virusa (WT), replikacija virusov pa je omejena. Glavne tri posledice okužbe z mutiranim virusom so povišana raven IFN, zmanjšana raven translacije virusa in smrt okuženih makrofagov.

Aktivacija različnih signalnih poti

Mutiran virus lahko aktivira tri različne signalne poti. Prva pot poteka preko MDA5 – to je RIG-u I podoben receptor, C terminalna domena receptorja pa deluje kot prepoznavna domena za dsRNA. Aktiviran MDA5 protein interagira z mitohondrijskimi antivirusnimi signalnimi proteini, kot rezultat pa dobimo fosforilirana interferonska regulatorna faktorja 3 in 7 (IRF3 in IRF7), ki se preneseta v celično jedro ter inducirata transkripcijo interferonskih genov. Naslednja signalna pot deluje preko PKR. To je z dsRNA aktivirajoča se proteinska kinaza, ki služi kot senzor dsRNA v celici. Aktivirana PKR fosforilira evkariontski iniciacijski faktor 2α (eIF2α), ki inhibira translacijo gostiteljeve in virusne mRNA. Makrofagi, okuženi z mutiranim virusom, ki ni imel EndoU aktivnosti, so kazali višje ravni fosforiliranega eIF2α in nižjo raven translacije v primerjavi z divjim tipom virusa. Zadnja pa je OAS-RNaza L signalna pot. OAS je družina 2',5' – oligoadenilat sintetaz, ki ob aktivaciji z interferoni sintetizirajo 2',5'-oligoadenilate (2-5A). Ti se vežejo na RNazo L, ki deluje kot glavna ribonukleaza in povzroča razgradnjo gostiteljevih ter virusnih RNA.

Posredovanje nsp15 pri izogibu gostiteljevega odziva

Najverjetnejši način delovanja nsp15 je razgradnja dsRNA. Ta predstavlja obvezen replikacijski intermediat pozitivnih ssRNA virusov, služi pa tudi kot pomemben s patogenom povezan molekulski motiv (PAMP) v citoplazmi okuženih celic. Mutiran virus, ki ne vsebuje EndoU aktivnosti, ne more cepiti nastajajoče dsRNA. Nsp15-posredovana cepitev ne zmanjša količine celokupne dsRNA v celici, ampak povzroči hidrolizo daljših dsRNA, da nastanejo dovolj kratke, ki se izognejo zaznavi gostiteljevih senzorjev.

Literatura

1. Deng X, Baker SC. An “Old” protein with a new story: Coronavirus endoribonuclease is important for evading host antiviral defenses. Virology. 2018;517: 157–163. doi:10.1016/j.virol.2017.12.024

2. Pillon MC, Frazier MN, Dillard LB, Williams JG, Kocaman S, Krahn JM, et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease Nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 2021;12: 636. doi:10.1038/s41467-020-20608-z

3. Snijder EJ, Decroly E, Ziebuhr J. The Nonstructural Proteins Directing Coronavirus RNA Synthesis and Processing. Advances in Virus Research. Elsevier; 2016. pp. 59–126. doi:10.1016/bs.aivir.2016.08.008

4. Deng X, Hackbart M, Mettelman RC, O’Brien A, Mielech AM, Yi G, et al. Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 2017;114: E4251–E4260. doi:10.1073/pnas.1618310114