Vloga malih nekodirajočih RNA pri regulaciji RNA metabolizma rastlin

Uvod

Male RNA (sRNA) so 20 – 31 nukleotidov dolge nekodirajoče molekule RNA, ki na različne načine sodelujejo pri regulaciji izražanja genov. Med te, ki imajo regulacijsko vlogo, najpogosteje prištevamo mikroRNA (miRNA), malo interferenčno RNA (siRNA) in PIWI-interagirajoča RNA (piRNA). Njihova glavna vloga v celici je RNA-interferenca (RNAi) oziroma RNA-vodeno utišanje genov, ki lahko poteka na več nivojih, in sicer transkripcijsko z epigenetskimi modifikacijami, post-transkripcijsko z razgradnjo mRNA in s translacijsko represijo. Pri vseh sodelujejo še AGO proteini, ki vežejo sRNA in skupaj z njimi tvorijo RISC kompleks (RNA-induciran kompleks za utišanje genov). V nadaljevanju se osredotočamo predvsem na pomen RNA-interference pri rastlinah, pri katerih sodeluje pri prilagoditvenih odzivih na spremembe v okolju in pomembnih razvojnih stopnjah, ter na njeno povezavo z retrogradno signalizacijo.

Sinteza malih RNA pri rastlinah

Sinteza miRNA se začne, ko RNA-polimeraza II prepiše gen za miRNA in nastane pri-miRNA, več kot 1000 nukleotidov dolga lasnična RNA molekula, ki še vsebuje 3' poli-A rep in 5' kapo. Nanjo deluje DCL1 (encim z endonukleazno aktivnostjo), kar vodi v nastanek pre-miRNA, 70 nukleotidov dolgo lasnično RNA. Sledi vezava kompleksa DCL1/3/4 s pomožnimi proteini HYL1, SE in TGH, kar vodi v nastanek dvoverižnega dupleksa z vodilno in tako imenovano »passenger« verigo. Na obeh 3' koncih se nahaja dva nukleotida dolg privesek, ki ga v citoplazmi metilira metiltransferaza HUA ENHANCER1 in s tem zavaruje molekulo pred uridilizacijo ter razgradnjo. Na koncu se miRNA dupleks s pomočjo šaperonov naloži na AGO1/10 in tvori aktiven miRISC kompleks, pri čemer v kompleksu ostane le vodilna veriga.

Za razliko od miRNA se siRNA ne prepiše iz lastnega gena, ampak se njena sinteza v celici prične, ko RNA polimeraza IV prepiše transpozone in ponavljajoče se regije. Primarni transkript ni podvržen DCL proteinom, ampak se najprej s pomočjo RNA-odvisne RNA polimeraze RDR2/4 podvoji, da nastane dvoverižna RNA. Šele takrat se prenese v citoplazmo, kjer jo DCL2/3/4 razreže na 20 – 24 nukleotidov dolge fragmente, ki se s pomočjo šeperona HSP90 naložijo na AGO4/6/9 in tvorijo siRISC kompleks.

Transkripcijsko utišanje genov

RNA-interferenca na ravni transkripcije poteka na osnovi epigenetskih modifikacij histonov in DNA. Gre predvsem za metilacije cisteinov in lizinskih aminokislinskih ostankov na histonih, kar vodi v nastanek heterokromatina, ki je prepisno neaktiven.

Metilacija histonov

Glavno vlogo pri sRNA vodeni metilaciji histonov ima kompleks za RNA-inducirano transkripcijsko utišanje genov – RITSC, ki ga sestavljata AGO1 z vezano siRNA, ki se med elongacijsko fazo transkripcije komplementarno veže na primarni transkript mRNA, ter Chp1, ki se s kromatin-vezavno domeno veže na histonsko modifikacijo H3K9me. Ko je RITSC enkrat močno vezan, lahko interagira s kompleksom CLRC, ki med drugim vsebuje tudi encim z metiltransferazno aktivnostjo – ta katalizira nadaljno metilacijo histonskega lizina. Na metilirano mesto se še dodatno veže Swi6, homolog heterokromatinskega proteina 1 (HP1), ki še dodatno stabilizira strukturo heterokromatina. Transkripcija se zaključi z disociacijo RNA-polimeraze, ki jo na neznan način katalizira RITSC.

Metilacija DNA

RNA-odvisen DNA metilacijski kompleks sestavljata siRNA v kompleksu z AGO4 in metiltransferaza DRM2, ki ima katalitično vlogo. Do vezave na primarni transkript pride zaradi komplementarnosti s siRNA, medtem ko za stabilizacijo in organizacijo kompleksa skrbita KTF1, ki kompleks povezuje tako z RNA-polimerazo kot s predhodno prisotnim 5-metilcitozinom na DNA, in RDM1, ki kompleks povezuje z metiltransferazo DRM2. Za uspešeno utišanje je potreben še katalitično neaktiven DRM3, ki pripomore k usmerjanju in stabilizaciji DRM2.

miRNA vodeno utišanje genov

Poti razgradnje mRNA se prepletajo s številnimi mehanizmi utišanja genov, katere vodijo male RNA - predvsem miRNA. Te regulirajo komplementarne mRNA z induciranjem represije translacije in njihovo razgradnjo. Za utišanje tarčnih mRNA se miRNA za delovanje poveže z RISC (RNA-induciran kompleks za utišanje genov), in tako deluje na utišanje genov z dvema mehanizmoma - miRNA voden razkroj mRNA ter miRNA vodena translacijska represija.

miRNA voden razkroj mRNA

Tako pri rastlinah kot tudi pri živalih, RISC inducira razgradnjo s cepitvijo na mRNA mestu nasproti sRNA nt 10 in 11. Pri živalih miRNA promovirajo destabilizacijo z rekrutiranjem deadenilaz na tarčne mRNA preko GW182 proteina, s čimer postane poliA rep bolj dostopen encimom. Protein interagira z dvema deadenilaznima kompleksoma, CCR4–NOT (bolj ključen kompleks, glavni vzrok za miRNA vodeno deadenilacijo in razkroj) in PAN2–PAN3, ter s poliA vezavnim proteinom (PABP), ki veča učinkovitost deadenilacije - stopnja razkroja se tako veča z večanjem dostopnosti poliA repa deadenilazam. RISC direktno promovira odstranjevanje kape in posledično tudi mRNA razkroj z rekrutiranjem decapping aktivatorjev (npr. DDX6) na kompleks deadenilaz, ki olajšajo delovanje decapping encimov (npr. DCP2). Po deadenilaciji in odstranitvi kape sledi razgradnja 3’ razrezanega konca v 5’ proti 3’ smer z XRN1, razgradnja 5’ razrezanega konca pa od 3’ proti 5’ v eksosomu.

Pri rastlinah pa vse poteka nekoliko drugače. Rastlinske miRNA ne morejo promovirati deadenilacije, vendar lahko direktno usmerjajo rezanje mRNA. miRNA se vežejo na skoraj popolnoma komplementarna tarčna mesta, ki so večinoma v ORF, in inducirajo endonukleolitično cepitev na mRNA med nukleotidoma nasproti nukleotidoma 10 in 11 na miRNA. Po razrezu je 3’ konec razgrajen z eksoribonukleazami (XRN4), razgradnja 5’ konca pa je lahko pri določenih vrstah pospešena z uridilacijo na 3’ koncu s HEN1 supresorjem 1 (HESO1). Razgradnja tako 3’ kot tudi 5’ konca torej poteka od 5’ proti 3’ z XRN4.

miRNA vodena translacijska represija

Pri živalih so z različnimi genomskimi analizami podprli dejstvo, da miRNA inhibirajo prvi korak v translaciji, vendar še ni popolnoma jasno kako točno. Predlagani so trije mehanizmi, ki se med seboj najverjetneje tudi prekrivajo, izvajajo simultano ali pa zaporedno:

• GW182 voden premik PABP,
• rekrutiranje translacijskih inhibitorjev prek GW182,
• miRNA vodena disociacija eIF4A

Pri rastlinah pa ima vsaka rastlinska miRNA nekaj specifičnih tarčnih mRNA s popolnim ali skoraj popolnim komplementarnim zaporedjem. Rastline za razliko od živali za razgradnjo in translacijsko represijo ne potrebujejo ključnega GW182 proteina, vendar najverjetneje miRNA same inducirajo transkripcijsko represijo in tarčno rezanje. Pri translacijski represiji so vključeni faktorji, kot sta na primer ALTERED MERISTEM PROGRAM1 (AMP1) in njegov homolog, LIKE AMP1 (LAMP1) - oba integralna membranska proteina, ki asociirata z endoplazemskim retikulumom (ER) in sta tesno povezana (ang. coimmunopercipitaded) preko Ago1. Dokazali so, da se z amp1 lamp1 dvojnim mutantom izrazi povečana asociacija miRNA-tarčnih mRNA z membransko vezanim polisomom (vendar ne s celotnim), kar lahko kaže na izvajanje translacijske represije na ER. miRNA inhibirajo translacijo z vezanjem tarčnih mRNA na transkripcijsko neaktivno mesto ER (zaznamovano z manjšo ribosomsko gostoto na tarčnih mRNA, ki so na membrani ER), hkrati pa veliko miRNA asociira s polisomom, kar pomeni, da najverjetneje rastlinske miRNA sodelujejo tudi kasneje na post-iniciacijski stopnji. Z umetno ustvarjenimi miRNA dupleksi in Ago proteini so znanstveniki uspeli producirati RISC z želeno kombinacijo Ago proteina in miRNA sekvence. S takšnim sistemom so pokazali, da lahko AGO1-RISC inhibira iniciacijo translacije brez deadenilacije in mRNA razkroja, hkrati pa tudi blokira rekrutiranje in premikanje ribosomov, če je sistem vezan na UTR ali ORF na mRNA. Poleg tega pa so ugotovili, da je za prepoznavanje tarčnih mest potrebno bolj podrobno in natančno parjenje baz v primerjavi z živalmi.

RNA editiranje

RNA editiranje se lahko zgodi ko-transkripcijsko ali post-transkripcijsko, gre pa za spremembo primarnih transkriptov z dodajanjem, izbrisanjem ali substitucijami nukleotidov. Genska informacija, ki jo nosi RNA molekula je tako drugačna od tiste, ki je zapisana na DNA. Pogosto služi kot popravljalni mehanizem, saj lahko obnavlja kodone ali pa ustvari start/stop kodon. Obstajajo različne modifikacije, npr. pretvorba citidina v uridin ali obratno, pretvorba adenozina v inozin, insercija ali delecija uridina, insercija gvanozina. Pri rastlinah najpogosteje opazimo pretvorbo citidina v uridin. Pri tem so ključni proteini poddružine PLS PPR proteinov – kot genetski faktorji so odgovorni za editiranje RNA v kloroplastih in mitohondrijih.

Retrogradna signalizacija

Kloroplasti in mitohondriji so semi-avtonomni organeli, kar pomeni, da imajo svoj genom in lastne proteine. Med plastidi in jedrom poteka retrogradna signalizacija: kloroplasti in mitohondriji lahko regulirajo ekspresijo jedrnih genov v primerih celičnega stresa. Primera: a) Stres aktivira kompleks GUN1-MORF2-PPR, ta spremeni RNA editiranje v kloroplastih in posledično ima vlogo retrogradnega signala za aktivacijo ali inhibicijo ekspresije genov v jedru. b) Retrogradni signali, ki jih sproži plastokinon v kloroplastih, regulirajo alternativno izrezovanje RNA v jedru kot odgovor na spremembo redoks stanja elektron prenašalnih fotosintetskih komponent. Zunanje razmere – svetloba oz tema odločajo, kako se bodo geni v jedru prepisali – ko je svetloba, ta povzroči hitrejše delovanje RNA polimeraze II in posledično hitrejšo elongacijo RNA verige, medtem ko je v temi ta počasnejša. Pri vseh teh procesih sodelujejo sRNA. Raziskave so pokazale, da majhne mitohondrijske visoko izražene RNA (smithRNA) lahko regulirajo izražanje jedrnih genov. SmithRNA interagirajo z AGO2, ki je ključna komponenta RNAi mehanizma pri živalih – utišanja genov z dvoverižno RNA. sRNA-ji vplivajo tudi na posttranskripcijski RNA metabolizem, in sicer 3'-fosfatoadenozin-5'-fosfat (PAP), ki je retrogradni signal iz kloroplastov, inhibira aktivnost proteina XRN2, kar privede do akumulacije sRNA-jev. Ti pa vplivajo na metabolizem RNA tako, da utišajo izražanje tarčnih genov. Vsa ta odkritja dokazujejo, da sta RNA metabolizem in retrogradna signalizacija tesno povezana procesa, ki regulirata drug drugega.

Vloga RNA metabolizma in sRNA vodene regulacije genov v rasti, razvoju in stresnih odgovorih rastlin

RNA metabolizem je zelo pomemben za pretok genske informacije od DNA do proteinov, zato je njegova regulacija ključna za pravilno delovanje in razvoj organizmov. Različni sRNA-ji so udeleženi pri regulaciji mnogih procesov pri rastlinah, kot so čas cvetenja, homeostaza kovinskih ionov, razvoj rastlinskih organov ter odgovor na stres. miRNA (micro RNAs) so pomembni za regulacijo splošnega razvoja rastline, medtem ko siRNA-ji (small interfering RNAs) vplivajo na obrambne mehanizme rastline – razgrajujejo tuj genski material in utišajo izražanje genov patogenov. Poleg tega pa tudi regulirajo znotrajcelične imunske receptorje in stabilizirajo gene, povezane z imunskim odzivom ter kontrolirajo njihovo ekspresijo.

Delovanje sRNA vodene regulacije na primeru regulacije rasti korenin pri rastlinah: sodelujejo hormon auksin ter razne sRNA. Ti vplivajo na razne transkripcijske faktorje (ARFs – auxin-response factors). miRNA167 in miRNA160 targetirata ARF6, ARF8 in ARF17, ki regulirajo nastajanje nadomestne/adventivne korenine v odvisnosti od svetlobe. V prisotnosti svetlobe ta aktivira pozitivna regulatorja ARF6 in ARF8 ter zavira negativen regulator ARF17, v temi se dogaja obratno. Regulacija rasti nadomestne korenine poteka prek izražanja z auksinom induciranih GH3 genov. Ti geni so odgovorni za pretvorbo jasmonske kisline v neaktivno obliko, zmanjšanje koncentracije jasmonske kisline pa vodi v formacijo nadomestne korenine. ARF17 je represor izražanje teh genov in posledično korenina ne nastane. Svetloba povzroči aktivacijo ARF6, ta aktivira še ARF8 in ta dva spodbujata formacijo nadomestne korenine ter inhibirata izražanje ARF17. Istočasno pa ARF6 regulira tudi samega sebe prek negativne povratne zanke – aktivira ARF17 in miRNA167, ki sta njegova inhibitorja, tako se prepreči preveliko povečanje količine ARF6. V temi se kopiči večja koncentracija faktorja ARF17, ki aktivira miRNA167, ta pa posledično inhibira ARF8 in ARF6; ARF17 pa tudi sam inhibira ARF6.

Zaključek

RNA metabolizem je sestavljen iz širokega spektra med seboj povezanih procesov, ki v celici igrajo pomembno vlogo pri izražanju genov. Čeprav je na tem področju znanega že veliko, naše znanje še ni popolno – sploh pri poznavanju mehanizmov, kot so na primer translacijska represija in retrogradna signalizacija v koreninah. Velik poudarek je potrebno nameniti tudi malim RNA in z njimi povezani RNA-interferenci, ki omogoča ciljno utišanje genov in ima tako velik terapevtski (utišanje mutiranih genov, onkogenov ter virusov), genetski (funkcijska analiza genov) in biotehnološki potencial (gensko spremenjene rastline).

Viri

1. Castel, S.E. and Martienssen, R.A. (2013) ‘RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond’, Nature Reviews Genetics, 14(2), pp. 100–112. Available at: https://doi.org/10.1038/nrg3355.

2. Dawar, P. et al. (2024) ‘RNA Metabolism and the Role of Small RNAs in Regulating Multiple Aspects of RNA Metabolism’, Non-Coding RNA, 11(1), p. 1. Available at: https://doi.org/10.3390/ncrna11010001.

3. Iwakawa, H. and Tomari, Y. (2015) ‘The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression’, Trends in Cell Biology, 25(11), pp. 651–665. Available at: https://doi.org/10.1016/j.tcb.2015.07.011.

4. Shankar, N. and Nath, U. (2024) ‘Advantage looping: Gene regulatory circuits between microRNAs and their target transcription factors in plants’, Plant Physiology, 196(4), pp. 2304–2319. Available at: https://doi.org/10.1093/plphys/kiae462.

5. Zhao, X., Huang, J. and Chory, J. (2020) ‘Unraveling the Linkage between Retrograde Signaling and RNA Metabolism in Plants’, Trends in Plant Science, 25(2), pp. 141–147. Available at: https://doi.org/10.1016/j.tplants.2019.10.009.