Vpliv strukturnih značilnosti 5’-UTR na kontrolo translacije pri evkariontih

Uvod

Regulacija translacije je pri evkariontih v glavnem regulirana v procesu iniciacije. Na napredovanje iniciacijskega kompleksa, ki se sestavi na 5’-kapo, vplivajo specifična nukleotidna zaporedja na 5’-nekodirajoči regiji (5’-UTR), kot so terminalni oligopirimidinski trakt in navzgor odprti bralni okvirji. Pomembno vlogo imajo tudi posebne strukture RNA (steblo-zanke, psevdovozli, RNA-stikala in G-kvadropleksi) in njihovi regulatorni elementi. Znotraj 5'-UTR regije se pojavljajo tudi modifikacije mRNA, najpogosteje metilacije različnih dušikovih baz. Regulacija translacije je možna tudi preko trans regulacijskih elementov, ki prepoznajo in se vežejo na specifična zaporedja znotraj 5'-UTR (RBPs, miRNAs in lncRNAs).

Regulacija preko sekvenc 5'-UTR

Terminalni oligopirimidinski trakt

Končni oligopirimidinski trakt (TOP) je sestavljen iz 4 do 15 pirimidinskih nukleotidov in se nahaja po zaporedju navzdol neposredno za m7G kapo. V klasičnem TOP zaporedju je na položaju +1 vedno prisoten citidin. TOP sekvenca se pri človeku nahaja v mRNA vseh ribosomskih proteinov, prisotna pa je tudi v mRNA genov, ki kodirajo proteinske faktorje, kot so eIF3, eIF4A, eIF2 in PABP. Prisotnost TOP regije pred drugimi geni lahko nakazuje njihovo neposredno povezavo s translacijo. Številni taki transkripti so povezani z onkogenezo, kar pomeni, da bi lahko z uravnavanjem translacije teh genov vplivali na razvoj raka. Regulacija translacije preko TOP regije poteka na podlagi energijskega ravnovesja v celici in se lahko izvaja tudi neodvisno od klasičnih poti, kot sta mTORC1 in PI3K. Glavno vlogo pri regulaciji ima protein LARP1 (angl. La ribonucleoprotein 1). La-domena LARP1 se veže na 3' poli-A-rep in na protein PAB (vezavni protein za poli-A-rep). Domena DM15, ki je aktivirana z defosforilacijo, blokira sestavljanje prediniciacijskega kompleksa preko interakcije z regijo TOP. V primeru pomanjkanja hranil je mTORC1 neaktiven, ter ne fosforilira domene DM15, zaradi česar je ta aktivna in zaustavi proces translacije mRNA. LARP1 ima še številne druge regulativne funkcije, med drugim uravnava dolžino poli-A-repa prek interakcije s poli-A-polimerazami, kar povzroči prednostno prevajanje zaporedij z daljšimi poli-A-repi.

uORF in začetni kodoni

Navzgor odprti bralni okvirji (uORFs) so protein kodirajoče regije, ki ležijo navzgor od glavnega kodirajočega zaporedja, v 5'-UTR. Običajno so uORF kratka zaporedja (dolga do 300 nukleotidov, v povprečju pa 60 nukleotidov), ki imajo start kodon pred primarnim start kodonom. uORF-ji katerih stop kodon se lahko nahaja znotraj glavnega kodirajočega zaporedja, se imenujejo prekrivajoči se uORF. Za optimalno vezavo male ribosomske podenote je potrebno Kozakino zaporedje. Če se nahaja zraven start kodona uORF, pride do zaustavitve 48S kompleksa zaradi močne vezave kar povzroči zmanjšanje prevajanja glavnega kodirajočega zaporedja. V primeru, da Kozakino zaporedje ni prisotno, pride le do šibke vezave kompleksa. Pojavi se t.i. “leaky scanning”, kar pomeni, da kompleks ne zazna start kodona in nadaljuje s skeniranjem - posledično se zmanjša inhibitorni učinek uORF. Začetek translacije se lahko pojavi tudi na nekanoničnih začetnih kodonih (CUG, GUG, UUG itd.), vendar z bistveno manjšo učinkovitostjo. Na inhibitorno delovanje uORF vpliva njegova dolžina in oddaljenost stop kodona od start kodona glavnega kodirajočega zaporedja. Pri dolgih uORF-jih translacija poteka dlje časa, kar pomeni, da ribosomi zasedejo več iniciatorskih faktorjev. Prav tako večja razdalja od glavnega start kodona poveča čas, ki ga eIF2 potrebuje za vezavo. Vpliv na inhibitorne lastnosti uORF-ja pa imajo tudi spremembe v njegovem nukleotidnem zaporedju, saj zapis za redke kodone upočasni napredovanje ribosoma. Zaustavitev ribosoma pa lahko sprožijo tudi različni aminokislinski motivi. Prolin je slab donor in akceptor za tvorbo peptidne vezi, kar povzroči zastoj transkripcije, ko ribosom naleti na tri ali več zaporednih prolinov (PPP). Za nastanek peptidne vezi v poliprolinskem motivu ribosom potrebuje faktor eIF5A, ki vsebuje postranslacijsko modifikacijo aminokisline lizin, t.i.hipusin. Poleg svoje regulatorne funkcije nekateri uORF mRNA kodirajo funkcionalne mikropeptide, ki sodelujejo pri aktivnosti produkta CDS ali prevzamejo vlogo, ki je od njega neodvisna.

Regulatorni elementi struktur RNA v 5′-UTR regiji

Steblo-zanke in psevdovozli

Prisotnost steblo-zanke (angl. stemloop) v regiji 5′-UTR lahko spodbuja (v primeru ATF4) ali zavira translacijo, kar lahko opazimo pri regulatornem elementu IRE (angl. iron-responsive element) v 5′-UTR regiji feritina. Proteini IRP1/2, ki uravnavajo raven železa, se ob pomanjkanju vežejo na to sekundarno strukturo in jo stabilizirajo, kar posledično preprečuje potek translacije. Uravnavanje translacije je mogoče tudi s psevdovozlom. Človeška mRNA IFN-γ vsebuje psevdovozel v 5'-UTR regiji. Translacija je regulirana s povratno zanko protein kinaze R (PKR). IFN-γ aktivira PKR s pomočjo psevdovozla, kar povzroči povečano fosforilacijo eIF2α in zmanjšano translacijo IFN-γ.

RNA-stikala

Pomembni strukturni elementi, vsebovani v regiji 5'-UTR, so RNA-stikala (angl. riboswitches). Uravnavajo izražanje genov s spreminjanjem strukture RNA zaradi selektivne vezave ligandov. V evkariontih je njihova prisotnost redkejša. Uravnavanje translacije s pomočjo RNA-stikal pri kvasovki S. pombe je mogoče z vezavo ligandov SAM (S-adenozilmetionin) in spermidina, ki povzročita konformacijsko spremembo strukture RNA v 5'-UTR regijah genov sam1 in spe2. V bakterijah RNA-stikala uravnavajo izražanje genov, povezanih z metaboliti, kar lahko uporabimo kot tarče za razvoj zdravil proti bakterijskim okužbam.

G-kvadrupleksi

RNA G-kvadrupleksi (RG4) so stabilne strukture tvorjene iz zaporedij, bogatih z gvaninom. Sestavljeni so iz ploščatih kvartetov gvaninov, ki tvorijo negativno nabit karbonilni kisikov center, ki pripomore h koordinaciji pozitivno nabitih kationov (K+, NH4+ in Na+). Razlog za povečano stabilnost RG4 v primerjavi s kvadrupleksi DNA je zamenjava timina z uracilom in sladkor riboza. Te lastnosti omogočajo paralelno konformacijo, kjer so vse štiri verige enako usmerjene. RG4 predstavlja oviro, ki vpliva na gibanje ribosoma in s tem na sintezo proteinov. Učinek RG4 je odvisen od njegove lokacije. Vstavljanje G-kvadrupleksa 20 bp pred začetnim kodonom zmanjša učinkovitost translacije brez spreminjanja transkripcije. Da lahko stabilen RG4, ki se nahaja pred ORF, moti delovanje ribosoma in zavira translacijo, so dokazali z uporabo reporterjev za več genov (NRAS, TERF2, ATR , BCL2, NRXN2 idr.). S pomočjo NRAS so dokazali tudi, da ima največji učinek RG4, ki se nahaja najbližje 5'-kapi in vsebuje veliko število kvartetov. Številne helikaze (DHX36, DHX9, DDX21, DDX2 (eIF4A)) in proteini, ki vežejo nukleinske kisline (CNBP in hnRNP H/F), vplivajo na povezovanje in razvijanje RG4. DHX36 helikaza spodbuja odvijanje kvadrupleksov in translacijo. Pri proliferaciji matičnih celic skeletnih mišic, je ekspresija DHX36 povečana, kar aktivira translacijo genov, ki imajo RG4 v 5'-UTR. Kvadrupleks, ki je del IRES v 5'-UTR gena za VEGF, usmerja ribosomsko podenoto 40S in s tem spodbuja translacijo neodvisno od 5'-kape. RG4 lahko spodbuja translacijo neodvisno od IRES. To dokazuje primer, kjer je bila translacija zaviralca apoptoznega proteina cIAP1 zmanjšana zaradi motnje v RG4.

IRES

IRES (angl. internal ribosome entry site) predstavlja notranje vstopno mesto za ribosom. Je struktura, prvotno najdena v virusih, ki spodbuja neposredno vezavo ribosoma na mRNA in omogoča translacijo neodvisno od 5′-kape. Nekateri izmed njenih mehanizmov regulacije so ITAF (angl. IRES trans-acting factors), RG4 in uORF. ITAF so proteini ali regulatorne RNA, ki aktivirajo IRES s spremembo njegove konformacije. Imajo pomembno vlogo pri odzivu celice na stres. Translacija uORF pred strukturo IRES zavira aktivnost le-tega. Translacija uORF, ki je del IRES, pa lahko spodbuja ali zavira nastanek aktivne strukture IRES. Translacija uORF, kot del strukture IRES v mRNA cat-1, spremeni sekundarno strukturo in aktivira IRES. Nasprotno pa translacija uORF znotraj strukture IRES VEGF zavira aktivnost. RG4 lahko omogoča aktivnost IRES predvsem z neposredno vezavo ribosoma. Ugotovili so, da RG4 na 5'-koncu gena BAG1 spodbuja translacijo neodvisno od 5'-kape, čeprav ni del strukture IRES. Možno je, da je RG4 ključen za stabilizacijo strukture IRES z usmerjanjem elementa ITAF.

Modifikacije mRNA

Znotraj 5'-UTR regije se pojavljajo tudi modifikacije mRNA, najpogosteje metilacije različnih dušikovih baz. Te spremembe pomembno vplivajo na procesiranje in stabilnost mRNA ter samo translacijo. Dobro poznana metilacija gvanina se ne pojavi le kot m7G kapa na 5' koncu, temveč tudi tekom 5'-UTR regije. Neposredno za kapo se lahko pojavlja m6Am modifikacija, kjer je metiliran adenin na N-6 mestu in riboza na 2'-O mestu. Izsledki raziskav glede posledic spremembe niso enotni. Prav tako metode označevanja niso dovolj specifične, saj ne ločujejo med m6Am in m6A modifikacijami. Pri slednji gre za modifikacijo adenina na N-6 mestu, ki se pojavlja tekom celotne mRNA in na dva načina promovira od 5’ kape neodvisno translacijo. Omogoča neposredno vezavo eIF3 iniciacijskega faktorja, sestavo 43s prediniciacijskega kompleksa ter potek translacije brez sodelovanja eIF4F kompleksa. Prav tako lahko na translacijo preko m6A vplivajo bralni proteini. Družina proteinov z YTH domeno (najpogosteje protein YTHDF3) preko neposredne vezave na spremenjen nukleotid poveča sintezo zapisanih proteinov na mRNA. Metilacija na mestu N-1 adenozina (m1A) predstavlja izomer m6A. Pogosto se pojavlja ob mestu iniciacije translacije ter blizu nestandardnih mest začetka translacije. Ker je metilacija na mestu N-1, se preko njega ne morejo tvoriti vodikove vezi kot predvideva Watson – Crickovo pravilo baznih parov. Namesto tega pride do tvorbe vezi preko N-7, kar povzroči zasuk baze in posledično konformacijsko spremembo sekundarnih struktur. Pogostost pojavljanja modifikacije se poviša v stresnih pogojih, kot so oksidativni stres in stradanje. Znotraj 5'-UTR se pojavlja tudi metilacija na N-5 mestu citozina (m5C), ki lahko zavre proces translacije, vendar je to bolj značilno za omenjene modifikacije znotraj kodirajoče regije. Redko pride tudi do zamenjave adenozina z inozinom. Modifikacija je vredna omembe, saj vpliva na že omenjene RG4 komplekse. Acetilacija na N-4 mestu citozina (ac4C) je v akademski skupnosti odprt predmet raziskav, saj ni enotnega mnenja niti glede vprašanja, ali se ta v človeški mRNA sploh pojavlja. Vseeno pa naj bi glede na določene raziskave translacijo spodbujala v primeru lokacije ob nestandardnih start kodonih (CUG) ter zavirala na mestu -1 glede na AUG znotraj Kozakine sekvence.

Trans regulacijski elementi

Regulacija translacije je možna tudi preko molekul, ki prepoznajo in se vežejo na specifična zaporedja znotraj 5'-UTR, na primer RNA vezavni proteini (RBPs), microRNAs (miRNAs) in komplementarne dolge nekodirajoče RNA (lncRNAs). Primer mehanizma vezavnih proteinov predstavlja HuD, ki se veže na 22. nukleotidni segment 5'-UTR regije mRNA, ki kodira za preproinzulin (Ins2 mRNA). HuD deluje kot inhibitor in zavre translacijo prekurzorja inzulina. Nasprotni učinek ima miRNA-196b, ki domnevno tekmuje s HuD za vezavo oziroma prepreči tvorbo zanke in vezavo proteina HuD. Posledično lahko translacija preproinzulina poteka. Primer dolge nekodirajoče RNA predstavlja protismerna RNA, ki posttranskripcijsko regulira izražanje gena za protein ubikvitin karboksi-terminalno hidrolazo L1 (Uchl1). Sestavljena je iz dela komplementarnega zaporedju na mRNA Uchl, ki predstavlja vezavno domeno in efektorske domene, ki spodbuja translacijo. Slednja vsebuje več kratkih razpršenih jedrnih elementov (SINEs), specifično SINEB2, ki mora biti pravilno orientiran. Družino novo odkritih dolgih nekodirajočih RNA molekul, ki vsebujejo SINEs in spodbujajo translacijo so poimenovali SINEUPs, vendar natančen mehanizem njihove regulacije še ni pojasnjen.

Zaključek

Kljub temu da 5’-UTR regija predstavlja nekodirajoč del mRNA se izkaže, da imajo strukturne značilnosti regije velik vpliv na učinkovitost translacije in s tem na sintezo proteinov. Regulacija predstavlja dinamičen proces, ki vključuje različne cis in trans elemente, s čimer omogoča celici, da se bolje prilagodi na okoljske spremembe in stresne situacije. Metode raziskovanja mehanizmov so zaenkrat še pomanjkljive, vendar celostno razumevanje regulacije predstavlja veliko možnosti za razvijanje novih orodij in pristopov zdravljenja znotraj sintetične biologije, biotehnologije in biomedicine.

Viri

• A. C. Panda et al., “miR-196b-Mediated Translation Regulation of Mouse Insulin2 via the 5′UTR,” PLOS ONE, vol. 9, no. 7, p. e101084, Jul. 2014, doi: 10.1371/journal.pone.0101084.
• A. G. von Arnim, Q. Jia, and J. N. Vaughn, “Regulation of plant translation by upstream open reading frames,” Plant Sci., vol. 214, pp. 1–12, Jan. 2014, doi: 10.1016/j.plantsci.2013.09.006.
• C.-Y. Lee, M. Joshi, A. Wang, and S. Myong, “5′UTR G-quadruplex structure enhances translation in size dependent manner,” Nat. Commun., vol. 15, no. 1, p. 3963, May 2024, doi: 10.1038/s41467-024-48247-8.
• E. Razumova, A. Makariuk, O. Dontsova, N. Shepelev, and M. Rubtsova, “Structural Features of 5′ Untranslated Region in Translational Control of Eukaryotes,” Int. J. Mol. *Sci., vol. 26, no. 5, Art. no. 5, Jan. 2025, doi: 10.3390/ijms26051979.
• K. D. Meyer et al., “5′ UTR m6A Promotes Cap-Independent Translation,” Cell, vol. 163, no. 4, pp. 999–1010, Nov. 2015, doi: 10.1016/j.cell.2015.10.012.