Z biosenzorjem usmerjen inžiniring Cupriavidus necator H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola

Izhodni članek: Biosensor-informed engineering of Cupriavidus necator H16 for autotrophic D-mannitol production

Uvod

Podnebne spremembe predstavljajo gorečo krizo, ki je bila v zadnjih letih potisnjena v ospredje družbene diskusije. Za spopad s to krizo je nujno zmanjšanje našega negativnega vpliva na okolje. Pri tem je veliko govora o znižanju izpustov toplogrednih plinov, ki segrevajo okolje. Med štirimi najpomembnejšimi je najbolj znan CO₂. Industrijska proizvodnja kemikalij je leta 2020 proizvedla 920 Mt CO₂ [1]. Da bi dosegli cilj ogljično nevtralne družbe do leta 2050, ki so si ga zastavili Združeni narodi [2] je nujno razogljičiti tudi proizvodnjo kemikalij. Veliko raziskav poteka v smeri uporabe katalizatorjev za pretvorbo nereaktivnega atmosferskega CO₂ v industrijsko uporabne komponente. Relativno malo pa je bilo narejeno na področju uporabe bioloških organizmov v industrijske okolju. Pri tem je med bolj obetavnimi skupina mikroorganizmov, ki akumulirajo atmosferske pline. Med omenjene spada bakterija Cupriavidu necator, ki v odsotnosti organskih substratov fiksira CO₂ preko reduktivne pentoza fosfatne poti. Do sedaj so preko genetskega inženiringa pripravili seve, ki proizvajajo metil ketone, izopropanol, alkane in alkene. Vendar je večino produktov proizvedenih preko piruvata in acetil-CoA pridobljenih skozi Enter-Doudoroffovo potjo [3].

Bakterija C. necator

C. necator je Gram negativna nepatogena bakterija. Je fakultativni kemolitotrof, kar pomeni da je zmožna prehajanja med avtotrofnim in heterotrofnim metabolizmom. Pod avtotrofnimi pogoji pridobi heksoze direktno iz CO₂ in vode preko Calvin-Benson-Basshamove (CBB) poti. Energijo in reducirajoče okolje pa priskrbijo hidrogenaze, ki oksidirajo H₂. Vsebuje štiri hidrogenaze tipa [Ni-Fe], ki so posebne v tem, da tolerirajo O₂ in jih CO₂ ne inhibira [3–5].

Cilj raziskave

Erik K.R. in sodelavci so se odločili pripraviti sev C. necator, ki bo proizvajal D-manitol. Manitol se v prehrambni industriji uporablja kot sladilo, saj ima ničelni glikemični indeks. V medicini se uporablja kot diuretik za zdravljenje edema, hidrocefalusa in glavkome. Industrijska sinteza manitola poteka preko hidrogenacije fruktoze, kar proizvede racemat sorbitola in manitola. Manitol pa je iz takšne zmesi težko ločiti od sorbitola in kovinskega katalizatorja reakcije. Po biološkem postopku se proizvaja preko postopka fermentacije mlečnokislinskih bakterij in kvasovk s fruktozo in glukozo kot virom ogljika [3].

Načrt

Kot šasijo so uporabili C. necator H16, kateri so vgradili različne encime za biosintezo manitola ter biosenzorski sistem za oceno učinkovitosti vstavljenih encimov. CBB cikla bakterij C. necator proizvede gliceraldehid-3-fosfat, ki se pretvori v fruktozo-bisfosfat in nadaljnjo v fruktozo-6-fosfat. V organizmih, ki proizvajajo manitol za zalogo energije je fruktoza-6-fosfat začetna komponenta biosinteze. Tako so se odločili dodati encima manitol 1 fosfat dehidrogenazo in manitol 1 fosfat fosfatazo. Manitol 1 fosfat dehidrogenaza pretvori fruktozo-6-fosfat v manitol-1-fosfat, tega pa manitol 1 fosfat fosfataza defosforilira v manitol. Biosenzorski sistem pa je vseboval promotorsko regijo, ki je ob prisotnosti manitola sprožila prepisovanje rdečega fluorescenčnega proteina (RFP) [3].

Preverjanje encimov

Začeli so s testiranjem učinkovitosti encimov iz različnih organizmov. Izbrali so encime iz E. siliculosus, E. tenella, P. putida, A. baylyi, C. pasteurianum in M. pusilla. Gene so vstavili v vektor pEH031 pod nadzorom P_BAD promotorja. Isti vektor je vseboval tudi reporterski konstrukt. Prvo so preverili sintezno sposobnost manitola v minimalnem mediju preko RFP proteina. Vsi sevi so imeli signifikantno večjo fluorescenco 24 h po dodatku arabinoze. Seva z encimi iz E. siliculosus in A. baylyi pa sta v odsotnosti arabinoze imela višjo fluorescenco kot negativna kontrola. Največjo fluorescenco, skoraj 5-krat višjo od ostalih sta imela seva z encimi iz E. siliculosus in P. putida. Da so preverili delovanje reporterskega sistema so dodali eksogeni manitol v končni koncentraciji 0,2 % in ta je povzročil 97-kratni dvig nivoja fluorescence. Arabinoza dodana sevu z vektorjem brez sinteznih encimov ni povzročila povišanje fluorescence, kar nakazuje da je zaznano povišanje povezano s sintezo manitola [3].

Heterotrofna proizvodnja v manjših volumnih

Nadaljevali so s proizvodnjo pod heterotrofnimi pogoji v majhnem volumnu. Celice so ponovno gojili v minimalnih gojiščih z dodanim glukonatom kot virom ogljika. Koncentracija manitola v 24 h po indukciji je bila največja pri sevih z encimi iz E. siliculosus, P. putida in A. baylyi. Ostali sevi so imeli koncentracijo pod mejo zaznave. Trije najboljši so proizvajali manitol tudi ob odsotnosti arabinoze. Celice z encimi E. siliculosus so pred indukcijo proizvedle manitol v koncentraciji 21,6 mg/L in 24 h po indukciji dosegle 429 mg/L [3].

Optimizacija knocentracije induktorja z uporabo biosenzorja

Del optimizacije sistema za izražanje z inducibilnim promotorjem je izbira primerne koncentracije induktorja, pri čemer želimo čim večjo količino našega produkta in živih celic. Za določitev optimalne koncentracije induktorja so celice gojili v bogatem mediju, saj je pri takšnih pogojih prepisovanje vzdrževalnih genov povišano. Testirali so končne koncentracije induktorja od 0.019 mM do 10 mM. Fluorescenco so normalizirali glede na optično gostoto izmerjeno pri 600 nm in za vsak sev določili optimalno koncentracijo arabinoze. Pri vseh je bilo opaziti zmanjšanje optične gostote z večanjem koncentracije arabinoze. Dodatek arabinoze divjemu tipu C. necator v istih koncentracijah ni imelo vpliva na optično gostoto celic. Najmanj se je optična gostota zmanjšala pri sevu z encimi iz P. putida (18 %) in največ pri sevu z encimi iz M. pusilla (84 %) [3].

Heterotrofna proizvodnja v večjih volumnih

Opremljeni s podatki optimalne koncentracije induktorja in rezultati izražanja v majhnem volumnu so se preverili še proizvodnjo v večjih volumnih. Izbrali so prej omenjen tri najboljše seve in jih gojili v bogatem mediju. Izražanje so inducirali s tremi koncentracijami induktorja. Poleg optimalne, ki so jo določili so izbrali še višjo in nižjo. Induktor so dodali med eksponentno fazo rasti in vzorce so odvzeli 12 h po indukciji. Preverili so fluorescenco supernatanta in celični usedlini [3]. Vsi sevi so največ manitola proizvedli ob največji koncentraciji arabinoze. Manitol se je pri skoraj vseh izražanjih v večjem deležu nahajal zunaj celice. Največji delež zunajceličnega manitola je proizvedel sev z encimi iz E. siliculosus. Sev z encimi iz A. baylyi je proizvedel največjo celokupno količino manitola (277 mg/L), sledil mu je sev z encimi iz E. siliculosus (245 mg/L), najmanj pa je proizvedel sev z encimi iz P. putida (54 mg/L). Ob odsotnosti arabinoze sta dva najboljša seva imela fluorescenco višjo od negativne kontrole. Ker predvidevajo, da je puščanje promotorja pri vseh sevih enako pripisujejo pojav povišani katalitični ali prevajalni zmožnosti encimov iz E. siliculosus in A. baylyi [3].

Avtotrofna proizvodnja

Zaradi dobrih rezultatov seva z encimi iz E. siliculosus so ta sev izbrali za avtotrofne teste. Pripravili so tri seve, kjer so encima integrirali v kromosom C. necator. Pri sevu NM0010 so nadomestili phaCAB operon z zapisi encimov pod vplivom heterolognega arabinoznega promotorja. Za preverjanje vpliva konstitutivnega izražanja so za promotor phaC integrirali zapise za encima iz E. siliculosus in tako pripravili sev NM0013. Da so preverili vpliv biosinteze PHB na biosintezo manitola so integrirali encime iz E. siliculosus na predel operona tcuAB skupaj z arabinoznim promotorjem in pripravili sev NM0011 [3]. Seve so inokulirali v bioreaktorje s pritokom CO₂ (35,1 L/h) in H₂ (1.35 L/h) in O₂ reguliranim na 4 %. Suha masa celic po 167 h fermentacije je bila 5,5 g/L za NM0010; 14,2 g/L za NM0011 in 4.9 g/L NM0013. Seva NM0013 in NM0010 sta dosegla maksimum suhe mase že po 71 h, medtem ko se je masa seva NM0011 povečevala vse do 143h. Končna koncentracija manitola pa je bila 3.9 g/L za NM0010; 3,3 g/L za NM0011 in 2,6 g/L za NM0013. Izkoristki med 53,5 in 71 h izračunani preko molov ogljika porabljenega za manitol glede na mole ogljika iz porabljenega CO₂ so bili 0,48 za NM0010; 0,16 za NM0011 in 0,26 za NM0013. V časovnem območju med 71 h in 94 h je izkoristek seva NM0010 narastel preko teoretičnega limita vse do 2,74. To so pripisali padcu prevzema CO₂ in zmanjšanju suhe mase celic, kar pomeni da se je za proizvodnjo manitola začel uporabljati ogljik iz celic, pridobljen predhodno. Odstranitev sinteznih genov za PHB je zmanjšala biomaso celice in 2 do 3-krat povečala pretvorbo CO₂ v manitol [3].

Primerjava z drugimi postopki

Maksimalna proizvodnja manitola rekombinantnih C. necator med 53,5 in 71 h je ocenjena na 94 mg/L/h, kar je večje od 6,3 mg/L/h in 0,004 mg/L/h dobljenih z rekombinantnimi cianobakterijami. Oba organizma sta uporabljala CO₂ kot vir ogljika, vendar podatka o izkoristku glede na mol CO₂ ni [3]. Trenutno najpogosteje uporabljena biološka metoda za proizvodnjo manitola je ekstrakcija iz alg. Na 1 kg alg dobijo 300 g manitola in za to porabijo 30 m2 površine. V enem tednu lahko v 0,2 m3 bioreaktorju proizvedejo 710 g manitola [3].

Zaključek

V raziskavi so uspeli pripraviti rekombinanten sev bakterije C. necator, ki učinkovito pretvarja atmosferski CO₂ v industrijsko uporaben manitol. Pokazali so tudi uporabnost biosenzorskih sistemov pri izbiri biosinteznih encimov in sevov. Podobne raziskave predstavljajo dobro izhodišče za razvoj sistemov za proizvodnjo kemikalij v smislu krožnega gospodarstva.

Viri

[1] Chemicals – Analysis - IEA. https://www.iea.org/reports/chemicals. [pridobljeno Maj.08.2022].

[2] Carbon neutrality by 2050: the world’s most urgent mission | United Nations Secretary-General. https://www.un.org/sg/en/content/sg/articles/2020-12-11/carbon-neutrality-2050-the-world’s-most-urgent-mission. [pridobljeno Maj.08.2022].

[3] E. K. R. Hanko, G. Sherlock, N. P. Minton, N. Malys, Biosensor-informed engineering of Cupriavidus necator H16 for autotrophic D-mannitol production, Metab. Eng., vol. 72, str. 24–34, Jul. 2022.

[4] Cupriavidus necator - Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Cupriavidus_necator. [pridobljeno Maj.08.2022].

[5] J. Panich, B. Fong, S. W. Singer, Metabolic Engineering of Cupriavidus necator H16 for Sustainable Biofuels from CO2, Trends Biotechnol., vol. 39, no. 4, str. 412–424, Apr. 2021.