|
|
| Line 2: |
Line 2: |
|
| |
|
| == Uvod == | | == Uvod == |
| Rezistentne bakterije v današnjem svetu predstavljajo veliko težavo, saj zaradi njih letno umre kar 700 000 ljudi, v naslednjih 30 letih pa naj bi se ta številka povzpela do 10 miljonov. K hitri odpornosti bakterij prispevamo predvsem s prekomerno uporabo in zlorabo antibiotikov. Problem je v predpisovanju antibiotikov za virusne in blažje bakterijske okužbe ter nedokončane terapije z njimi. Predvsem pa bi k zmanjšanju števila odpornih bakterij pripomogla zmanjšana uporaba antibiotikov v živinoreji - v ZDA se namreč kar 80% vseh kupljenih antibiotikov porabi za zdravljenje živine. Posledično je danes veliko učinkovin že neuporabnih, pridobivanje novih pa je dolgotrajen in drag proces. Zato je potrebno razmisliti o alternativnih možnostnih, kakršna je tudi fagna terapija.
| | Bakterije uporabljajo različne mehanizme za spremljanje okoljskih signalov; dvokomponentne sisteme, transkripcijske faktorje in male RNA. V določenih primerih je okolje definirano z enim signalom, kot je prisotnost ali odsotnost male molekule (operoni lac, trp, fur). V drugih primerih je potrebna integracija več različnih signalov za specifično zaznavanje okolja. Tudi signali, ki so sami po sebi preveč splošni za karekterizacijo okolja (pH, temperatura, osmolarnost) lahko delujejo specifično v kombinaciji. Podoben problem nastane, ko programiramo celice za identifikacijo okolja, ki ni naravno prisotno in nima enega dominantnega signala. V teh primerih so pomembna logična vrata za integracije več signalov in uspešno identifikacijo okolja. |
|
| |
|
| ==== Fagna terapija ====
| | Leta 2007 so prvič v E. coli uspešno vnesli sistem logičnih IN vrat, katerega pomembna lastnost je modularnost. Mikroorganizmi uporabljajo genetska vezja za integracijo okoljskih informacij. V tej študiji so pripravili sintetična IN vrata, ki integrirajo informacijo iz dveh vhodnih promotorjev (vhodni signal) in aktivirajo izhodni promotor (izhodni signal), le ko sta oba vhodna promoterja transkripcijsko aktivna. Integracija poteče preko interakcije med mRNA in tRNA. Sistem je modularen, ker so vhodni in izhodni signali promotorji. S spremembo vhodnih promotorjev lahko sistem vežemo na različne vhodne signale, medtem ko sprememba izhodnega promotorja lahko povzroči drugačen celični odziv. |
| Fagna terapija se je za zdravljenje bakterijskih okužb uporabljala že pred odkritjem antibiotikov, po odkritju penicilina pa se je opustila zaradi večje zanesljivosti zdravljenja z antibiotiki. Ob vse večjem porastu multirezistentnih bakterij je zanimanje za fagno terapijo ponovno veliko. Bakteriofagi imajo namreč velik terapevtski indeks, zato se z uporabo fagne terapije pričakuje malo stranskih učinkov. Velika prednost je njihova specifičnost, saj ena vrsta faga lahko okuži le določeno vrsto bakterije. Fagna terapija bi zmanjšala število oportunističnih okužb, ker bi z uporabo določenega bakteriofaga odstranili le patogeno bakterijo, bakterije črevesne flore pa bi preživele. Bakteriofagi so tudi veliko bolj uspešni pri prodoru skozi biofilme in lahko prehajajo krvno možgansko bariero. Poleg tega pa naj bi terapija z bakteriofagi omogočala manjšo možnost, da bakterija razvije odpornost.
| |
|
| |
|
| == Bakteriofagi in CRISPR/Cas9 == | | == Modularna IN vrata == |
| CRISPR/Cas9 je bakterijski imunski sistem, ki bakterije brani pred tujo DNA. CRISPR sistem sestavljajo kratki palindromni segmenti DNA z enakim zaporedjem, med njimi pa se nahajajo vmesniki, ki so si med seboj različni. Ti vmesniki nastanejo, ko bakterijo napade tujek. Ko bakterija tujek uspešno razgradi, se med palindromna zaporedja vgradijo delci tuje DNA. Če je ob naslednjem napadu tuja DNA homologna vmesniku, se bo iz CRISPR sistema prepisala gRNA in do nje vodila endonukleazo Cas9. Encim bo cepil tarčno DNA le pod pogojem, da je poleg protovmesnika tudi PAM sekvenca. Prirejeni CRISPR sistemi se sedaj uporabljajo za modificiranje genov.
| | In vrata z dvemi vhodnimi signali aktivirajo izhodni signal, le ko sta oba vhodna promotorja aktivna (ON). Idealno je, da je sistem modularen, kar pomeni, da lahko vhodne in izhodne signale z lahkoto zamenjamo. V transkripcijskih sistemih je prikladno, da so povezave med signali promotorji. Izhodni promotor lahko aktivira izražanje gena, ki proizvede določen celični fenotip ali pa deluje kot vhodni promotor v naslednja IN vrata. |
| Geni tega sistema so bili nedavno uspešno integrirani tudi v genom lizogenih fagov. Ko je modificiran fag s CRISPR geni injiciran v bakterijo, se CRISPR aktivira in cilja bakterijske tarčne gene. Ironično bi torej uporabili bakterijski obrambni sistem proti njim samim. Ponovno dovzetnost bakterij na antibiotike so pokazali že v clankih [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4237163/ ''Citorik et al. (2014)''] in [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4317352/ ''Bikard et al. (2014)'']. V teh primerih so uporabili enofagni sistem za cepitev rezistenčnih genov, ki so bili zapisani na plazmidih.
| |
|
| |
|
| == iGEM projekt - Edinburgh ==
| | V študiji so pripravili tri različne sisteme IN vrat in tako dokazali modularnost. |
| Skupina iz Edinburgha je letos zastavila projekt, ki je v boju proti rezistenci na antibiotike naredil še korak dlje. Projekt so zastavili na podlagi članka iz leta 2015, [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26060300 Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria]. Njihova taktika je drugačna od običajne enofagne metode – rezistentne bakterije bi z dvofagnim sistemom v kombinaciji s CRISPR sistemom spremenili tako, da bi bile te ponovno dovzetne za že obstoječe antibiotike. V osnovi naj bi modificiran lizogeni fag v bakterijo prenesel CRISPR sistem, ki je zasnovan za cepitev genov, odgovornih za razvoj rezistence. Nato bi bakterijsko populacijo izpostavili še litičnim fagom, ki so narejeni tako, da vsebujejo enake fragmente rezistenčnih genov, ki jih cilja CRISPR. To pomeni, da bo vsaka bakterija, v kateri je cepitev rezistenčnih genov uspela, imuna na infekcijo z litičnim fagom. Torej v tem primeru je sistem torej zasnovan tako, da imajo selektivno prednost neodporne bakterije, kar tudi zmanjša možnost razvoja rezistence na lizogeni fag.
| |
| S projektom so želeli nadgraditi delo iz prej omenjenega članka in ustvariti pribor za ponovno senzibilizacijo bakterij. Ker trenutno največji problem predstavljajo multirezistentne ESKAPE bakterije, se je ekipa odločila identificirati 2 gena, ki v teh bakterijah povzročata odpornost. Prvi gen, ''blaKPC'' (''KPC'') kodira za karbapenemazo iz ''Klebsielle'', encim pa je odgovoren za rezistenco na β-laktamske antibiotike. Odpornost povzroča v nekaterih gram negativnih bakterijah. Drugi identificirani gen je ''vanA'', katerega produkt je odgovoren za rezistenco na glikopeptidne antibiotike. Takšen je vankomicin, ki deluje na nekatere gram pozitivne bakterije.
| |
| Ker so kot šasijo uporabili ''E. coli'', so morali uporabiti primerne bakteriofage, s katerimi bodo vnašali CRISPR sistem. Izbrali so lizogena faga P1 in λ ter litična faga T4 in T7. P1 so izbrali, ker je dobro okarakteriziran, se hitro pakira in ima dvakrat večjo kapaciteto kapside kot fag λ, kar je pri delu s fagi pomembna lastnost. Fag P1 pa se je v kombinaciji s T7 že izkazal za uspešnega v predhodnih študijah.
| |
| Za delo so izbrali tudi 3 različne CRISPR sisteme, ki prepoznajo različne PAM sekvence. ''SaCas9'' je CRISPR sistem tipa II iz ''Staphylococcus aureus'' in je s 1053 aminokislinami najmanjši, kar je ugodno za delo z bakteriofagi. ''SpCas9'' je sistem iz ''Streptococcus pyogenes'', ki pa ga zaradi pravic intelektualne lastnine v tem projektu ne opisujejo. Zadnji je CRISPR sistem tipa V iz bakterije ''Francisella novicida'', ''FnCpf1'', ki je zaradi kratke crRNA cenejši in lažji za pripravo.
| |
|
| |
|
| ==== Priprava posnemovalnega patogena ====
| | V prvem primeru so pripravili IN vrata z vhodnimi signali arabinoza in salicilat. Z aktivacijo ustreznih vhodnih promotorjev (Pbad in Psal) pride do aktivacije izhodnega promotorja Pt7 in izražanja proteina GFP. Tako dobimo fluorescenčne celice le ob prisotnosti dveh vhodnih signalov v okolju. Mehanizem IN vrat deluje preko interakcije različnih RNA molekul. Aktiviran Pbad zažene transkripcijo gena za polimerazo T7, ki pa ima dva vmesna amber stop kodona. Taka mRNA je translacijsko neaktivna. Aktivira jo gen supD, ki ga aktivira Psal. SupD je gen za tRNA, ki utiša amber (TAG) stop kodon in ga prekodira v kodon za serin. Na tak način le ob prisotnosti obeh vhodnih signalov v okolju pride do uspešne translacije polimeraze T7, ki aktivira izražanje GFP. |
|
| |
|
| Ker delo s patogenimi bakterijami ni dovoljeno, so kot šasijo uporabili več nepatogenih sevov ''E. coli'' (TOP10, DH5ɑ, C600, RecD- in BL21 DE3), v katere so vstavili plazmid z zaporedjem protovmesnikov. Najprej so želeli v plazmid vstaviti celotne zapise proteinov, ki povzročijo rezistenco na antibiotik. Ker pa uporaba potencialno nevarnega gena ni popolnoma v skladu z varnostnimi standardi, so plazmid spremenili tako, da so namesto celih sekvenc uporabili le kratke dele genov, ki služijo kot protovmesniki. Protovmesniške regije so bile skrbno izbrane tako, da ''E. coli'' ne bi mogla pridobiti rezistence na antibiotik. Izognili so se funkcionalnim regijam proteinov, vključili pa so visoko ohranjene regije iz različnih mikroorganizmov in jih tudi naključno razporedili. Izbrali so 4 protovmesnike iz gena ''blaKPC'' ali ''vanA'', pri tem pa pazili na kompatibilnost z vsemi tremi CRISPR sistemi. Enake protovmesniške regije so vstavili tudi v faga T4 in T7 za zagotovitev imunosti bakterijam, ki so bile uspešno senzibilizirane. Tako so ustvarili prvo vezje, ki nosi 51 baznih parov dolge protovmesnike izbranega rezistenčnega gena, ki so ločeni z linkerskim zaporedjem iz 6-8 glicinov in serinov. Drugo vezje je vsebovalo reporterski gen GFP z dvema terminatorjema. Ti dve sekvenci so združili s klonirnim sistemom MoClo. To je modularna strategija za kloniranje, ki uporablja restriktaze tipa ''IIS'' za uspešno sestavljanje do 6 DNA fragmentov naenkrat. Kot destinacijski vektor so uporabili MoClo vektor DVK-AF.
| | V drugem primeru so inpute zamenjali za dva naravna promoterja (quorum sensing in odzivnost na Mg2+). Pbad in Psal so zamenjali s PmgrB, ki se aktivira ob pomanjkanju Mg2+ in Plux, ki se aktivira ob prisotnosti acilhomoserina, ki je signal za celično gostoto. Pomanjkanje Mg2+ v E. coli zaznava dvokompontentni sistem PhoPQ. Ob znižani zunajcelični koncentraciji iona membranska komponentna PhoPQ fosforilira znotrajcelični regulator PhoPQ, ki aktivira PmgrB. Zaznavanje celične gostote (quorum sensing) je način komunikacije med bakterijami. Ta sistem je zelo pogosto uporabljen v sintetičnih genskih sistemih za programiranje celic, da tvorijo vzorce, regulirajo celično gostoto in ubijejo maligne celice kot odziv velike gostote. Lux promotor in luxR gen, iz V. fischeri, se inducira v odziv na eksogeni acilhomoserinlakton (AHS/AI-1). |
|
| |
|
| ==== Priprava CRISPR sistemov in kasete z vmesniki ====
| | V tretjem primeru so kot vhodna promotorja izbrali Psal in PmgrB (salicilat in Mg2+) in zamenjali izhodni signal GFP za Invazin. Tako aktivacija IN vrat omogoča invazijo bakterijskih celic. S tem poskusom so preverili ali lahko output IN vrat kontrolira celično obnašanje (invazivnost). Izražanje gena za invazin iz Y. pseudotuberculosis v E. coli omogoči invazijo sesalskih celic, ki imajo na površju B1-integrinski receptor. Sposobnost invazije so nato testirali, tako da so gojili bakterijske celice skupaj s sesalskimi. |
|
| |
|
| Za pripravo CRISPR sistema, ki bi bil kompatibilen z obema lizogenima fagoma, so SaCas9 kaseto pripravili tako, da so izboljšali že obstoječo biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2019000 Bba_K2019000] in ustvarili novo biokocko s ''FnCPf1'' kaseto. ''FnCpf1'', [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K2330000 ''SaCas9''] in ''SpCas9'' CRISPR sisteme so kodon-optimizirali za ''E. coli'' in jim odstranili mesta, ki niso dovoljena v biokockah. Za vse CRISPR sisteme so kot skelet izbrali P1 fagmid. Cas kaseta je bila zasnovana navzdol od ''Lac'' promotorja in [http://parts.igem.org/Part:BBa_J61117 Andersonovega RBS-ja]. Ker so konstrukti zelo veliki, so jih razdelili na 2 dela. Prvi del so ligirali v P1 fagmid prek restrikcijskih mest ''BsiWI'' in ''AvrII'', drugi del pa so v tako pripravljen fagmid ligirali s ''HindIII'' in ''AvrII'' v primeru ''FnCpf1'' ter ''ApaI'' in ''AvrII'' v primeru ''SaCas9'' in ''SpCas9''. Uspešnost uvedbe CRISPR sistema v P1 fagmid so preverjali z belo-modrim testom, saj se restrikcijski mesti ''BsiWI'' in ''AvrII'' nahajata v genu za ''LacZ''.
| |
| Kasete z vmesniki so pripravili posebej, kar je omogočalo hitro zamenjavo in posledično hitro testiranje več različnih genov. Vsako sekvenco vmesnikov so razdelili na 2 kaseti (''KPC''I in ''KPC''II ter ''vanA''I in ''vanA''II). Vmesniške dele so lahko kombinirali prek ''BbsI'' restrikcijskih mest in jih v plazmide s Cas sistemi vnesli prek ''BsaI'' mest. CRISPR sistem in vmesniki so bili pod ločenimi ''Lac'' promotorji. Navzdol od vmesniške kasete so dodali še [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0010 T1 terminator].
| |
|
| |
|
| ==== Priprava litičnih fagov ====
| |
|
| |
|
| Litična faga so pripravili tako, da sta vsebovala konce ''KPC'' in ''vanA'' regij, torej bi lahko en litični fag uporabili proti več različnim bakterijam. Za vstavitev protovmesniške regije v genom bakteriofaga so uporabili tehniko bakteriofagne rekombinacije elektroporirane DNA (BRED, ''angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA''), ki je osnovana na homologni rekombinaciji med bakteriofagom in dsDNA v bakteriji. Rekombinacijo omogočijo proteini homologne rekombinacije, ki so zapisani na plazmidu. V tem primeru so fagu T4 zamenjali neesencialni gen ''SegC'', fagu T7 pa gen ''1.7''.
| |
|
| |
| ==== Rezultati ====
| |
|
| |
| Skupini je uspelo ustvariti posnemovalnie patogene s protovmesniki iz ''blaKPC'' in ''vanA'', a žal niso zaznali razlike v fluorescenci med posnemovalnimi patogeni in kontrolnim sevom ''E. coli''.
| |
| Uspelo jim je skonstruirati CRISPR kaseto in kaseto z vmesniki ter ju uspešno vstaviti v fagmid P1. Poskusi so pokazali uspeh za oba CRISPR sistema in oba rezistenčna gena. Uspeli so pridobiti P1 fage, ki cepijo ''blaKPC'' in ''vanA'' gene. Oba sistema sta neuspešno cepila gen ''blaKPC'', gen ''vanA'' pa sta cepila z nizko uspešnostjo. V primeru faga λ jim ni uspelo dobiti pozitivnih rezultatov za noben CRISPR sistem. Neuspeh pojasnjujejo s prisotnostjo aktivnih restrikcijskih sistemov v uporabljenem sevu E. coli ali zaradi težav z elektroporacijo.
| |
| Pri konstruiranju faga T4 so zaznali uspešno homologno rekombinacijo med vmesniško kaseto in genom ''SegC''. Izolirali so tudi posamezne plake, a jih zaradi časovnih omejitev niso uspeli primerno očistiti. V fagu T7 jim je uspelo pripraviti produkt s protovmesniki ''KPC'' gena, ne pa z deli ''vanA'' gena.
| |
|
| |
|
| == Viri == | | == Viri == |
(Dominik Dekleva)
Uvod
Bakterije uporabljajo različne mehanizme za spremljanje okoljskih signalov; dvokomponentne sisteme, transkripcijske faktorje in male RNA. V določenih primerih je okolje definirano z enim signalom, kot je prisotnost ali odsotnost male molekule (operoni lac, trp, fur). V drugih primerih je potrebna integracija več različnih signalov za specifično zaznavanje okolja. Tudi signali, ki so sami po sebi preveč splošni za karekterizacijo okolja (pH, temperatura, osmolarnost) lahko delujejo specifično v kombinaciji. Podoben problem nastane, ko programiramo celice za identifikacijo okolja, ki ni naravno prisotno in nima enega dominantnega signala. V teh primerih so pomembna logična vrata za integracije več signalov in uspešno identifikacijo okolja.
Leta 2007 so prvič v E. coli uspešno vnesli sistem logičnih IN vrat, katerega pomembna lastnost je modularnost. Mikroorganizmi uporabljajo genetska vezja za integracijo okoljskih informacij. V tej študiji so pripravili sintetična IN vrata, ki integrirajo informacijo iz dveh vhodnih promotorjev (vhodni signal) in aktivirajo izhodni promotor (izhodni signal), le ko sta oba vhodna promoterja transkripcijsko aktivna. Integracija poteče preko interakcije med mRNA in tRNA. Sistem je modularen, ker so vhodni in izhodni signali promotorji. S spremembo vhodnih promotorjev lahko sistem vežemo na različne vhodne signale, medtem ko sprememba izhodnega promotorja lahko povzroči drugačen celični odziv.
Modularna IN vrata
In vrata z dvemi vhodnimi signali aktivirajo izhodni signal, le ko sta oba vhodna promotorja aktivna (ON). Idealno je, da je sistem modularen, kar pomeni, da lahko vhodne in izhodne signale z lahkoto zamenjamo. V transkripcijskih sistemih je prikladno, da so povezave med signali promotorji. Izhodni promotor lahko aktivira izražanje gena, ki proizvede določen celični fenotip ali pa deluje kot vhodni promotor v naslednja IN vrata.
V študiji so pripravili tri različne sisteme IN vrat in tako dokazali modularnost.
V prvem primeru so pripravili IN vrata z vhodnimi signali arabinoza in salicilat. Z aktivacijo ustreznih vhodnih promotorjev (Pbad in Psal) pride do aktivacije izhodnega promotorja Pt7 in izražanja proteina GFP. Tako dobimo fluorescenčne celice le ob prisotnosti dveh vhodnih signalov v okolju. Mehanizem IN vrat deluje preko interakcije različnih RNA molekul. Aktiviran Pbad zažene transkripcijo gena za polimerazo T7, ki pa ima dva vmesna amber stop kodona. Taka mRNA je translacijsko neaktivna. Aktivira jo gen supD, ki ga aktivira Psal. SupD je gen za tRNA, ki utiša amber (TAG) stop kodon in ga prekodira v kodon za serin. Na tak način le ob prisotnosti obeh vhodnih signalov v okolju pride do uspešne translacije polimeraze T7, ki aktivira izražanje GFP.
V drugem primeru so inpute zamenjali za dva naravna promoterja (quorum sensing in odzivnost na Mg2+). Pbad in Psal so zamenjali s PmgrB, ki se aktivira ob pomanjkanju Mg2+ in Plux, ki se aktivira ob prisotnosti acilhomoserina, ki je signal za celično gostoto. Pomanjkanje Mg2+ v E. coli zaznava dvokompontentni sistem PhoPQ. Ob znižani zunajcelični koncentraciji iona membranska komponentna PhoPQ fosforilira znotrajcelični regulator PhoPQ, ki aktivira PmgrB. Zaznavanje celične gostote (quorum sensing) je način komunikacije med bakterijami. Ta sistem je zelo pogosto uporabljen v sintetičnih genskih sistemih za programiranje celic, da tvorijo vzorce, regulirajo celično gostoto in ubijejo maligne celice kot odziv velike gostote. Lux promotor in luxR gen, iz V. fischeri, se inducira v odziv na eksogeni acilhomoserinlakton (AHS/AI-1).
V tretjem primeru so kot vhodna promotorja izbrali Psal in PmgrB (salicilat in Mg2+) in zamenjali izhodni signal GFP za Invazin. Tako aktivacija IN vrat omogoča invazijo bakterijskih celic. S tem poskusom so preverili ali lahko output IN vrat kontrolira celično obnašanje (invazivnost). Izražanje gena za invazin iz Y. pseudotuberculosis v E. coli omogoči invazijo sesalskih celic, ki imajo na površju B1-integrinski receptor. Sposobnost invazije so nato testirali, tako da so gojili bakterijske celice skupaj s sesalskimi.
Viri
- iGEM projekt skupine iz Edinburgha: PhagED
- Yosef, I., Manor, M., Kiro, R., Qimron, U. Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria. PNAS, 2015, 112, 7267-7272
