Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom

Pritisk na antibiotsko rezistenco

Leta 1928 je Alexander Fleming odkril penicilin, izredno učinkovit antibiotik, ki je v prvi polovici dvajsetega stoletja rešil mnogo življenj in bil masovno uporabljan. Toda hkrati z uporabo antibiotikov, se je začela tekma, saj so začeli nastajati na antibiotike rezistentni sevi bakterij. Več kot se je nekega antibiotika uporabljalo, več vrst bakterij je nanj razvilo rezistentnost. Dandanes se antibiotiki uporabljajo predvsem v zdravstvu ter živinoreji. Ker pa je uporaba mnogokrat nepreudarna in pretirana se poraja skrb, ali bo razvoj rezistentnih bakterij prehitel razvoj novih antibiotikov. Strah ni neracionalen, saj se vlaganje v razvoj povsem inovativnih antibiotikov zmanjšuje. Antibiotiki se v ogromnih količinah porabljajo pri masovni živinoreji za prehranjevalne potrebe človeške populacije. Tako se v iztrebkih, ki seveda vsebujejo ostanke antibiotikov, začne selektivni pritisk na bakterije, kjer se favorizirajo tiste z rezistenco, oziroma geni za rezistenco. V veliki meri se živalski iztrebki uporabljajo kot gnojila pri pridelovanju rastlinske hrane, kjer obstaja možnost prenosa rezistentnih bakterij na hrano, kar poraja vprašanja o nevarnostih za javno zdravje.

Vloga bakteriofagov pri širjenju rezistence

Bakteriofagi, bakterijski virusi, imajo dva poznana načina razmnoževanja oziroma delovanja. Prvi, najenostavnejši, je litični, kjer fag vbrizga svojo dednino v bakterijo, ta pa nato po vneseni informaciji izdela nove viruse, ki jih sprosti v okolje. Drugi, kompleksnejši način, je lizogen, kjer se virusna dednina vstavi v bakterijsko dednino. Ob aktivatorju (na primer stres) se virusna DNA prepisuje in prevaja, virus pa vstopi v litični cikel. Virusna dednina vsebuje informacije za beljakovinske komponente faga, replikaze, v posebnih in za to temo pomembnih primerih pa tudi bakterijske gene. Omenjeni bakterijski geni, ki se pojavljajo v dednini lizogenih fagov lahko kodirajo toksine, superantigene, T3SS (strukture, ki patogenim bakterijam omogočijo prenos škodljivih proteinov iz bakterijskega citosola direktno v gostiteljsko celico), proteine za pritrjanje na podlago (gostitelja) in gene, ki omogočajo rezistenco na antibiotike. Iz napisanega je razvidno, da imajo sami fagi pomemben vpliv na širjenje patogenih in drugih človeku nevarnih lastnosti po bakterijski populaciji. V resnici so fagi zelo pomembni za kontrolo bakterijskih populacij, pri biogeokemijskih procesih in pri samem evolucijskem razvoju bakterij. Kar 20 % genov vseh bakterij naj bi bilo pridobljenih na omenjen način lizogenega cikla, a vpliv fagov na razvoj bakterij sploh še ni dobro raziskan. Ko virus prenese svojo dednino, ki vključuje bakterijske gene, v bakterijski kromosom, lahko to ne pomeni za gostiteljsko bakterijo nobenih sprememb, lahko so te negativne ali pozitivne. Prek evolucijskih mehanizmov se pozitivne lastnosti pri podvojevanjih, prek plazmidov, pa tudi prek litičnega cikla hitro razširijo po populaciji. V primeru živinoreje se torej ob prisotnosti fagov, ki vsebujejo rezistentne bakterijske gene, rezistentnost bakterij v živalskem gnoju hitro razširi zaradi antibiotskega pritiska na bakterije. Rezistentne bakterije lahko nato preko gnojenja in rastlinske hrane konzumirajo ljudje, kar predstavlja tveganje za javno zdravje, saj je tovrstne okužbe težko zdraviti (pomanjkanje delujočih antibiotikov). Iz napisanega je torej razvidno, da je za celovito borbo proti razširjanju antibiotske rezistence med bakterijami ključnega pomena, da se razišče vloga fagov v evoluciji bakterij, v odnosih z bakterijskimi kulturami in bolj usmerjeno, pri prenašanju in razširjanju genov rezistence po bakterijskih populacijah. Nadalje bo v seminarski nalogi opisan mehanizem in regulacija prenosa določenih bakterijskih genov (npr. nosijo gene za rezistentnost) v virusno dednino, ki se nato preko litičnega cikla lahko razširja po populaciji.

Posredniki prenosa genov

Bakterije imajo več mehanizmov, ki so zmožni pakiranja gostiteljske DNA v bakteriofage ali njim podobne delce. Gostiteljska DNA je v tem primeru DNA bakterije, ki pa lahko nosi tudi gene z rezistenco na antibiotike. Fagi in njim podobni delci prenašajo gene do novega bakterijskega gostitelja preko horizontalnega prenosa genov. Prenos tuje DNA, ki jo vršijo fagi, imenujemo transdukcija, ki jo lahko razdelimo na specializirano ali generalizirano. Pri prvi pride do prenosa dela gostiteljske DNA in profagne DNA v recipientsko celico, pri generalizirani pa pride do prenosa le dela gostiteljske DNA. Obstaja pa še en proces izmenjave genov, ki ga vršijo posredniki prenosa genov (PPG). To so majhni, bakteriofagom podobni delci, ki jih proizvajajo nekatere bakterije in arheje. Vsak delec vsebuje kratek fragment genoma, ki ga lahko prenese v recipientsko celico podobnega organizma.

Geni za te delce so nastali iz fagne DNA, ki se je integrirala v gostiteljski genom. Ta je mutirala na mestih, kjer je bil zapis za nastanek endolizina, na promotorju, DNA replikacijskem mestu in še nekaterih. Tako je iz 30 – 50 kb zaporedja nastalo 10 – 20 kb dolgo zaporedje z zapisom za pakiranje DNA, večino proteinov glave in repa. Dodatni geni, ki prispevajo k proizvajanju PPG ali vnosu DNA, se nahajajo na drugih mestih na genomu. Ti imajo lahko regulatorno vlogo ali direktno prispevajo k nastanku PPG, kot je na primer gen za endolizin. Taki geni kodirajo tudi za proteine, ki imajo funkcijo vnosa DNA in njeno rekombinacijo, kot so DNA transportni proteini.

Življenjski cikel PPG

Nastanek PPG je reguliran s pomočjo več regulatorjev. Gen gafA kodira transkripcijski regulator, ki se veže na PPG promotor in sproži nastanek strukturnih proteinov in proteinov za pakiranje DNA. Izražanje gafA je regulirano preko pleiotropičnega regulatorskega proteina CtrA in kvorum zaznavnega regulatorja GtaR. GafA in CtrA vplivata na zorenje PPG in končno sprostitev preko lize celice. GafA in GtaR z vezanim HSL (Homoserin lakton) pa sprožita nastanek endolizina in holina, ki sprožita lizo celice. Kadar je CtrA fosforiliran, to omogoča nastanek novih CtrA, hkrati pa deluje kot pozitivni regulator za nastanek določenih proteinov repa, bodic na glavi PPG in proteina za zorenje glave. Indukcija gena PPG torej vodi do produkcije proteinov, pomembnih za izgradnjo in vstavitev PPG, vendar pa, za razliko od bakteriofagov, ne prihaja do specifične replikacije samega gena.

Nastanek PPG se začne s transkripcijo in translacijo PPG genov. Nastali deli morajo dozoreti, torej proteini se morajo ustrezno sestaviti v določen del PPG. Sledi polnjenje glav PPG, kar regulira poseben terminazni encimski kompleks. Ta zapolni vsako glavo do maksimalne dolžine DNA, ki se lahko vstavi in se nato premakne naprej do naslednje glave. Maksimalna dolžina je 4 – 14 kb, kar je odvisno od bakterije, v splošnem pa velja, da lahko glave istega organizma sprejmejo enako količino DNA. Fagi lahko za razliko od PPG sprejmejo večjo količino DNA in prenašajo gene, ki kodirajo za nastanek več fagov. Po pakiranju pride do sestavljanja glav in repov ter končne lize celice.

Prenos dednega materiala

Uspešnost transdukcije s PPG je odvisna od zmožnosti njihovega preživetja v okolju in prisotnosti ustreznih recipientskih celic. Te morajo imeti na površini celice določen polisaharid, ki interagira z repom PPG. Ta nato razgradi zunanjo membrano na tem mestu in sprosti hidrolaze, ki razgradijo celično steno. DNA se lahko prenese le v periplazemski prostor, saj ne more direktno preiti notranje membrane, kot je to značilno za fage. Za prenos DNA so potrebni homologi DNA translokacijskih proteinov ComEC, ComF in ComM. Ti lahko preko membrane prenesejo le eno verigo DNA in ji dodajo DprA, ki omogoča lažjo rekombinacijo DNA verige. Ko ta kompleks prispe v citoplazmo, lahko rekombinacija poteče po enakem postopku, kot če bi bil vezan RecA.

Voda kot glavni problem onesnaženosti

Odpadna voda in rastline, ki jih obdelujejo z odpadno vodo, so lahko pravi rezervoar naravnih ponudnikov rezistence na antibiotike. So žarišče horizontalne transferacije genov, kar omogoča razširjanje genov za rezistenco na antibiotike (ARG) med bakterijami. Odpadna voda namreč vsebuje antibiotike, razkužila in kovine, ki lahko pripomorejo k antibiotični rezistenci že v nizkih koncentracijah. Bolnišnice predstavljajo zelo majhen del med viri antibiotikov, na antibiotike rezistentnih bakterij (ARB) in ARG. Zelo veliko jih vsebujejo tudi reke, na katerih poteka več raziskav in primerjav različnih ARG na večih delih reke. Občutljive bakterije lahko pridobijo gen za rezistenco preko transformacije, transdukcije ali konjugacije. Med pridobivanjem enega gena za rezistenco pa lahko v teh procesih bakterija sočasno pridobi tudi številne druge gene za rezistenco na druge antibiotike. Trenutno se za raziskave na tem področju najpogosteje uporabljajo metode, kot so kvantitativna PCR, metagenomika in funkcionalna metagenomika, razvoj novih metod pa konstantno prinaša nove možnosti za analizo ARG. Pridobitev rezistence je lahko naraven prilagoditveni proces, do nje pride preko spontanih mutacij ali pa se razvije preko horizontalne transferacije gena, ki ga pridobi od donorja, npr. druga bakterija, fagi, ali prosta DNA. Torej lahko tudi nepatogene bakterije, ki vsebujejo ARG, služijo kot rezervoar za patogene bakterije. Predvsem, ko gre za patogene bakterije, pa predstavlja rezistenca globalen problem. Več kot ena miljarda ljudi živi v pomanjkanju pitne vode. Čiščenje vode poteka preko filtracije in kloriranja, a za vse bolj onesnaženo vodo v sedanjem času, to ni zadovoljivo, saj ostane mnogo ARG v vodi. Pitje onesnažene vode je tako zelo ogrožajoče za javno zdravje. Predvsem ostanki neporabljenih antibiotikov v vodi verjetno spodbujajo ARB in ARG. Poleg tega lahko določeni mikrobi preživijo zdravljenje z antibiotiki, ter tako razvijejo rezistenco v odsotnosti genetske mutacije. Del populacije namreč ob velikem številu prisotnih bakterij, lahko preživi sicer letalno koncentracijo. Uporaba antibiotikov pod to koncentracijo tako lahko pripomore k razvoju rezistence tako v klinični medicini, kot v pridelavi rastlin in vzrejanju živali.

Načini preprečevanja

Obstaja več možnih sodobnih načinov za razkuževanje vode, ki pa zaenkrat še niso dobro raziskani. Ti vključujejo klor, ozon in železov reagent in lahko inaktivirajo ARB in ARG. Radikal ·OH je glavni oksidant v železovem reagentu. V reakciji radikala s proteinom, se ta razcepi na fragmente, njegova visoka reaktivnost s komponentami DNA in RNA pa povzroči njihovo poškodbo. Inaktivacija bakterij med razkuževanjem ne pomeni nujno uničenja ARG. Da deaktiviramo ARG, potrebujemo tako dezinfekcijsko sredstvo, ki čim hitreje prodre celično membrano in pride do DNA, ne da bi se vmes vezal kam drugam. Nekatere študije so preučevale tudi pomen ultravijoličnega (UV) obsevanja in ga primerjala s kloriranjem. Odkrili so, da tako kloriranje, kot UV obsevanje ne uničita veliko ARG, medtem ko v kombinaciji skupaj lahko zelo učinkovito inaktivirata ARG. Primerjava med obema metodama je pokazala, da UV obsevanje direktno uniči plazmid, ki vsebuje ARG, celična membrana pa ostane nespremenjena. Klor pa skupaj z amonijevim ionom, ki je prisoten v vodi, tvori kloramin, ki poveča permeabilnost celične membrane. Kloriranje vode lahko tako celo prispeva k transferaciji ARG, UV obsevanje je tako lahko primernejša oblika dezinfekcije za kontrolo ARG transferacije.

Viri

Redfield, R. J., Beatty, J. T., 2019, “Gene Transfer Agents.” Encyclopedia of Microbiology (Fourth Edition): 370 – 377.

Fogg, P.C.M., 2019, “Identification and characterization of a direct activator of a gene transfer agent.”Nature Communications 10. Article number: 595.

Sharma, V.K. et al. (2016) A review of the influence of treatment strategies on antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance genes. Chemosphere 150, 702–714

Karkman, A. et al. (2018) Antibiotic-resistance genes in waste water. Trends Microbiol. 26, 220–228