Razvoj robustnega sistema genetskega biozadrževanja kvasovk s stikalom za stabilnost proteinov

Povzeto po: Engineering stringent genetic biocontainment of yeast with a protein stability switch

Uvod

Ob vse večjih možnostih manipulacije z genomom vseh vrst organizmov, in hkratnemu strmemu padcu cene za to potrebnih orodij, področje sintezne biologije ponuja odgovore na vse več problemov, s katerimi se človeštvo sooča [1]. Kot pri vseh razvijujočih se tehnologijah pa je potrebno tudi na tem podoročju poskrbeti za varnostne protokole in postopke za minimizacijo tveganja.

Eden izmed glavnih faktorjev zagotavljanja varnosti ko pride do mikroorganizmov je biozadrževanje [2]. Sprememba laboratorijskih mikroorganizmov na tak način, da v naravi niso sposobni preživetja je ključna za zmanjšanje tveganja vnosa gensko spremenjenih mikroorganizmov v naravo. To lahko dosežemo na več načinov, najpogosteje z ustvarjanjem auxotrofičnih organizmov preko izbijanja genov, potrebnih za sintezo ključnih metabolitov, ali pa s kontrolo preko samomorilskih genov. Oba pristopa imata svoje probleme, auxotrofični organizmi lahko potrebne metabolite najdejo tudi v določenih naravnih okoljih, pri samomorilskih genih pa evulucijski pritisk pogosto vodi do mutacije na teh genih in njihove posledične inaktivacije [1],[2]. Tretji pristop se osredotoči na pozitivno kontrolo esencialnih genov preko pogojevanja njihovega prepisovanja ali stabilnosti s pogoji prisotnimi le v željenih okoljih [1],[2]. Članek se osredotoči na kontrolo stabilnosti esencialnh proteinov preko uvedbe oznake destabilizacijske domene, ki pa jo stabilizira prisotnost estradiola (ERdd – angl. destabilizing domain degron stabilized by estradiol addition).

Pregledovanje knjižnice za potencialne kandidate

Raziskovalci so najprej preverili vpiv destabilizacije ERdd na GFP z gojenjem kultur kvasovk S. Cerevisiae v prisotnosti in odsotnosti estradiola. V mediju brez estradiola je bila fluorescenca manjša za 95 %, celice v mediju z dodanim estradiolom pa v primerjavi s celicami brez ERdd oznake dosežejo 70 % fluorescence [2]. To nakazuje na možnost uporabe te oznake za namen kontrole stabilnosti esencialnih proteinov.

V nadaljevanju so raziskovalci uporabljali knjižnico kvasovk s proteini, označenimi z GFP (angl. yeast GFP collection), pri katerem je v posameznem sevu po en protein označen z GFP (knjižnica vsebuje 4159 sevov), za njim pa se nahaja še selekcijski marker HIS3MX6. Na podlagi te stalne regije so s pomočjo CRISPR/Cas9 sistema na koncu zapisa za GFP dodali oznako ERdd, hkrati pa zamenjali selekcijski marker HIS3MX6 za LEU2, kar je omogočalo lažjo selekcijo celic, ki so sprejele vnos. Spremenili so 94 % sevov z označenimi proteini, ki se v S. Cerevisiae štejejo med esencialne [2].

Vzpostavitev stabilne inducibilne integrirane celične linije (iRdRP)

HEK293T celično linijo so transfecirali s tremi lentivirusnimi vektorji iniciacijskega seta, da so sintetizirali iRdRP celično linijo. Aktivnost integriranega zapisa za RdRP so potrdili s testom replikacije segmenta genoma. Ta test uporablja plazmida PI-ΔHA-GFP in pDZ-NP. Prvi kodira vRNA za ΔHA-GFP, kjer je CDS za zeleni fluorescenčni protein (GFP) vstavljen med neprevajajoči se regiji vRNA za HA. Plazmid pDZ-NP, kjer celotno zaporedje za NP prepisujeta polimeraza I (Pol I) in polimeraza II (Pol II) v nasprotni smeri, pa izraža tako vRNA kot mRNA za NP. RdRP in proteini NP prepoznajo neprevajajoče se regije in tvorijo kompleks, ki omogoča od RdRP odvisno transkripcijo, kjer nastane GFP. Dokazali so, da tako pripravljena celična linija ob kotransfekciji prej omenjenih proteinov in indukciji z doksiciklinom proizvaja GFP, in tako potrdili, da celična linija izraža aktivno RdRP in NP proteine. Tako pripravljeno celično linijo so poimenovali iRdRP. iRdRP celice so nadalje pregledali za njihovo zmožnost priprave virusnih delcev. To metodo so uporabili tudi pri vseh kasneje sintetiziranih celičnih linijah. Za lažje razumevanje je ta metoda opisana pri celični liniji iRdRP 4v [2].

Celična linija, ki izraža 4 vRNA virusa influence (iRdRP 4v)

iRdRP celice so transfecirali z genomskim setom, ki nosi zapis za vRNA PB2, PB1, PA in NS, skupaj s transpozazno mRNA, ki je omogočila integracijo genomskega seta v genom celic iRdRP. Dokazali so, da indukcija izražanja vRNA in mRNA za PA, PB1, PB2 in NS močno poveča izražanje teh molekul v primerjavi z neinducirajočimi pogoji. Prisotnost molekule mRNA za NS, ki jo celice lahko proizvedejo le iz njene vRNA, predstavlja dodaten dokaz, da je bila prisotna aktivna RdRP, ki je bila sposobna vRNA za NS prepisati v mRNA. Integracijo vseh štirih genomskih segmentov so dodatno potrdili s kvantifikacijo števila kopij v teh klonih. Tako pripravljeno celično linijo so imenovali iRdRP 4v [2].

iRdRP 4v celice so nadalje ovrednotili glede na njihovo zmožnost priprave virusa sciΔHA (ang. single cycle infectious ΔHA) in virusa PR8 [2]. PR8 virus je virus gripe, za katerega je znano, da povzroča hude okužbe pri miših [4]. Set treh plazmidov z zapisom za vRNA in mRNA genov NP, M in NA so kotransfecirali pri inducibilnih pogojih z dodanima plazmidoma PI-ΔHA-GFP in pCAGGS-HA za sciΔHA virus in plazmidom pDZ-NP za virus PR8. Plazmid pCAGGS-HA nosi mRNA zapis za HA, pod kontrolo Pol II. Pri virusu PR8 so količino nastalega virusa pregledali z virusno titracijo supernatanta po infekciji celic MDCK, medtem ko so pri sciΔHA supernatant uporabili za infekcijo MDCK-HA celic in so prisotnost nastalega virusa določili s štetjem GFP pozitivnih celic. iRdRP 4v celična linija je prva demonstracija sinteze IAV genomskih vRNA iz v gostitelja integriranih genov in posledično pakiranja v virusne delce, ki so sposobni okužbe [2].

Inducibilne glavne celice darovalke (iMD)

iRdRP 4v celice so nadalje modificirali tako, da so integrirali tudi ojačevalni set, ki sestoji iz genov za NP in M pod promotorjem Pol I in inducibilnim promotorjem Pol II pSwitch, ki ga lahko induciramo z dodatkom mifepristona. Ponovno so pregledali zmožnost priprave virusa sciΔHA in virusa PR8, ter karakterizirali vpliv različnih pogojev indukcije na zmožnost replikacije virusnih genov. Karakterizacijo so izvedli z uporabo pretočne citometrije, kjer so merili emitiran GFP signal. Ugotovili so, da je indukcija TetON imela glavni vpliv na sintezo virusnih proteinov in podvojevanje virusnih genov, medtem ko je koindukcija pSwitch le malo izboljšala virusni titer [2].

Celice iMD so uporabili za pripravo virusa IAV-PR8. Transfecirali so jih s pDZ-NA in pDZ-HA ter inducirali z doksiciklinom in mifepristonom. Supernatant te kulture so uporabili za okužbo celic MDCK in detektirali prisotnost virusa PR8. Dokazali so, da se iMD celice lahko uporabljajo kot inducibilna pakirna celična linija za generiranje IAV virusov [2].

Dinamika virusne RNA v celicah iMD

Kljub temu, da so uspešno pripravili nalezljiv virus IAV, pa je bil končni proizveden titer sorazmeroma majhen. Da bi bolje razumeli dejavnike, ki omejujejo učinkovitost pakiranja virusa v celični liniji, so opravili analizo transkriptoma na celicah iMD, transfeciranih s pDZ-HA in pDZ-NA ter induciranih z doksiciklinom in mifepristonom. Podatke so analizirali s predhodno narejenim programom InVERT, ki kvantificira protismerno vRNA, smerno cRNA in mRNA, ki jo proizvede IAV lastna RdRP [2].

Ugotovili so, da je indukcija močno povišala količino vseh nastalih molekul RNA. Prisotnost posameznih molekul RNA pa je bila vseeno znatno manjša kot pri okužbi celic z IAV. V najmanjši meri so bile prisotne vRNA molekule, kar lahko predstavlja ozko grlo pri sintezi IAV. Da so potrdili to hipotezo so ocenili učinek povečanja proizvodnje IAV v celicah iMD s prekomernim izražanjem vRNA molekul z zapisom za PA, NP, M in NS. Celice so kotransfecirali s plazmidi, ki so imeli zapis za prej omenjene gene in opazili približno 10^2-kratno povečanje titra virusa PR8, kar nakazuje, da potencialno zvišanje ravni vRNA teh genov poveča število nastalih virusnih delcev [2].

Odziv celic iMD na prisotnost virusa

Okužba z IAV v gostiteljskih celicah sproži številne odzive, kot so zaustavitev transkripcije in translacije, vnetne reakcije in protivirusne odzive. V primeru iMD celic virusni material nastaja endogeno, za razliko od klasične eksogene okužbe z virusom. Odziv celic so raziskali tako, da so preučili transkriptom iMD celic 48 ur po transfekciji z pDZ-HA in pDZ-NA in po indukciji. Ugotovili so, da se transkriptom takšnih celic močno razlikuje od neinduciranih in netransfeciranih in tudi navadnih gostiteljskih celic [2].

Opazili so, da je bila, glede na HEK293T celice, prisotna povečana koncentracija genov za boj proti virusom že pred indukcijo, nekateri geni pa so se začeli povečano izražati šele po indukciji. Med geni, ki so bili prisotni v višjih koncentracijah, je bil DDX58 (RIG-I), receptor prirojenega imunskega sistema. Le-ta zazna v citoplazmi prisotno virusno RNA in sproži nadaljnje signalne poti, med njimi tudi sintezo IFNjev in provnetnih citokinov. Drugi geni so tudi IRF7, IFITM1, ISG20 in OAS3. Povečanje izražanja genov je verjetno posledica konstitutivnega izražanja vRNA in potencialno tudi puščanja promotorja za RdRP. Povečano izražanje teh genov okrepi obrambo celic pred virusom in negativno vpliva na proizvodnjo IAV. Nadalje bi lahko naredili celično linijo z izbitimi protivnetnimi virusi ali pa bi zmanjšali izražanje teh genov in znižali raven puščanja promotorja integriranih virusnih elementov [2].

Zaključek

V študiji so uspešno izdelali dokazno celično linijo, ki je zmožna proizvajati nalezljive IAV z nadzorovanim izražanjem vseh virusnih komponent. Sintetična celična linija odstrani potrebo po predhodni kotransfekciji velikega števila plazmidov za generiranje nalezljivih virusov. Analiza transkriptoma celičnih linij je prikazala ozka grla, ki jih lahko ciljamo za izboljšanje proizvodnje IAV, med njimi tudi nizke koncentracije vRNA in povečano koncentracijo protivirusnih genov. S prikazom izvedljivosti razvoja celične linije za pakiranje IAV je ta študija razkrila številne možnosti za optimizacijo tega sintetičnega sistema in njegove morebitne uporabe v industriji cepiv.

Literatura

1. Influenza A Virus and Acetylation: The Picture Is Becoming Clearer - PMC. [cited 28 Mar 2024]. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10820114/

2. Phan T, Ye Q, Stach C, Lin Y-C, Cao H, Bowen A, et al. Synthetic Cell Lines for Inducible Packaging of Influenza A Virus. ACS Synth Biol. 2024;13: 546–557. doi:10.1021/acssynbio.3c00526

3. Das AT, Tenenbaum L, Berkhout B. Tet-On Systems For Doxycycline-inducible Gene Expression. Curr Gene Ther. 2016;16: 156–167. doi:10.2174/1566523216666160524144041

4. Rutigliano JA, Sharma S, Morris MY, Oguin TH, McClaren JL, Doherty PC, et al. Highly Pathological Influenza A Virus Infection Is Associated with Augmented Expression of PD-1 by Functionally Compromised Virus-Specific CD8+ T Cells. J Virol. 2014;88: 1636–1651. doi:10.1128/JVI.02851-13