Molekulsko kloniranje

Predmet 3. letnika študijskega programa Biokemija. Izvaja se v zimskem semestru. Ima 30 h predavanj, 5 h seminarjev in 40 h laboratorijskih vaj, skupaj 5 kreditnih točk ECTS.

Nosilec predmeta: doc. dr. Marko Dolinar.

Vaje so ključni del predmeta, zato se izvajajo v majhnih skupinah. Izpitni roki (dva v zimskem in po en v poletnem in jesenskem izpitnem obdobju) vključujejo snov predavanj in vaj. Za snov z vaj pisnemu delu sledi ustni del, ki ga opravite pri svojem asistentu.

Teme predavanj

1. Kloniranje, pojem biološke varnosti in omejitve pri delu.
2. Zgodovina molekularne biotehnologije. Laboratorijski organizmi.
3. Encimi pri delu z DNA.
4. Elektroforezne metode.
5. Vektorske molekule. Reporterski geni.
6. Sinteza DNA in vitro. Sinteza cDNA. Priprava DNA-knjižnic. Transformiranje celic.
7. PCR in izvedene tehnike.
8. Hibridizacija, sonde, načini označevanja DNA. Presejanje knjižnic.
9. Določanje nukleotidnega zaporedja DNA (dideoksi-metoda).
10. Ekspresijski sistemi. Transkripcija/translacija in vitro.
11. Izražanje v prokariontih: vektorji, fuzije, optimizacija proizvodnje. Usmerjena lokalizacija, topnost, stabilnost, renaturacija.
12. Izražanje v kvasovkah, insektnih in sesalskih celicah.

Teme seminarjev

Seminarji bodo vključeni v termine predavanj, obdelali pa bomo nekatere ključne dosežke iz zgodovine molekulskega kloniranja. Del seminarjev bomo izvedli z delom po skupinah in poročanjem. Posebna tema seminarjev - za delo doma - bodo ocene tveganja za delo z GSO.

Teme laboratorijskih vaj

Navodila za vaje boste dobili pred začetkom vaj v formatu PDF. Teme vaj bodo:

1. Primerjava dveh metod za izolacijo plazmidne DNA, vloga dodatkov, agarozna elektroforeza.
2. Načrtovanje začetnih oligonukleotidov, konstruiranje rekombinantnih molekul (računalniška vaja).
3. Izolacija plazmidne DNA v srednjem merilu in ocena koncentracije.
4. Preparativno rezanje plazmidne DNA z restriktazami.
5. Izolacija DNA iz agaroznega gela.
6. Priprava kompetentnih celic.
7. Ligacija fragmentov DNA in transformacija bakterij. Analiza transformant.
8. Indukcija izražanja rekombinantne DNA.
9. Analiza topnosti rekombinantnega proteina. Lokalizacija rekombinantnega proteina in test biološke aktivnosti.

Vaje bodo dvakrat tedensko po 5 ur in bodo trajale 5 oz. 6 tednov. V vsaki skupini bo največ 10 študentov.

Izpitni roki

Izpitni roki v študijskem letu 2011/12 bodo:

• 18.1.2012
• 03.2.2012
• 29.6.2012
• 21.9.2012

Ocenjevanje

Ocena je sestavljena iz 5 % za seminar, 10 % za poročila z vaj, 35 % za kolokvij z vaj in 50 % za teorijo. Izpit je pisni in ustni. Popravljanje ocene je možno samo s ponovnim pisanjem izpita in hkrati kolokvija. Pogoj za opravljen izpit je, da iz teorije dosežete najmanj 50 % točk, da ste pripravili seminar, bili na vseh vajah in ste oddali poročila z vaj. Meje med ocenami bodo: do 9 % 1, do 19 % 2, do 29 % 3, do 39 % 4, do 48 % 5, do 58 % 6, do 68 % 7, do 77 % 8, do 86 % 9, 87 % ali več 10. Če se kdo prijavi na izpit, pa se potem ne odjavi, ne vračam prijavnice, vas pa odjavim, če to odločitev sporočite do trenutka, ko dobite v roke izpitna vprašanja oziroma po e-pošti do razpisane ure izpita.

Primeri sestavljanja ocene:

Prvi primer: Seminar 8, poročila z vaj 9, vprašanja z vaj 7, teorija 57 %. Ocena se sestavi takole: 8*0,5 + 9*1 + 7*3,5 + 57*0,5 = 4 + 9 + 24,5 + 28,5 = 66, kar pomeni končno oceno 7.

Drugi primer (zelo dober študent): Seminar 9, poročila 10, vprašanja z vaj 9, teorija 89 %: seštevek točk je 4,5 + 10 + 31,1 + 44,5 = 90,1, ocena 10.

Tretji primer (manj uspešen študent): Seminar 6, poročila 7, vaje 4, teorija 50 %: seštevek točk je 3 + 7 + 14 + 25 = 49, ocena 6.

Literatura

Twyman & Primrose: Principles of Gene Manipulation and Genomics. Oxford: Blackwell Publishing, 2006.