Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA

Uvod

Zorenje mRNA zajema več različnih kemijskih modifikacij in med drugim tudi dodajanje kape na 5’-koncu verige. Ta proces ima pomembno vlogo pri:

• povečevanju stabilnosti verige mRNA, saj jo kapa ščiti pred napadi eksonukleaz
• izvozu verige iz jedra, saj se nanjo lažje vežejo proteini, ki omogočajo transport
• izrezovanju 5’-introna
• pospeševanju translacije, saj spodbuja vezavo iniciacijskega faktorja (eIF4E).

Če molekuli mRNA omenjena struktura manjka, se bo razgradila v citoplazmi.

Proces dodajanja kape

Struktura kape na 5’-koncu mRNA nastane kotranskripcijsko in preide več encimskih reakcij. Proces se začne, ko je sintetiziranih že približno 20 nukleotidov. Najprej encim RNA-5’-trifosfataza (TPaza) z iniciacijskega nukleotida odstrani γ-fosfat. Nato se naslednji encim RNA gvanililtransferaza (GTaza) kovalentno poveže z α-fosfatom molekule GTP. Sprosti se molekula pirofosfata (PPi) in nastane intermediatni kompleks Encim-GMP. Ta kompleks omogoči prenos molekule GMP na prej omenjeni iniciacijski nukleotid. Produkt spojitve je struktura kape na 5’-koncu mRNA. Zatem sledi metilacija gvaninskega dela kape na mestu N7, kar omogoči encim (gvanin-N7)-metiltransferaza (N7-MTaza).

Opisani proces velja za tvorbo kape-0, za katerega se predvideva, da poteka tudi pri koronavirusih. Rečemo mu tudi konvencionalni mehanizem dodajanja kape. Pri višjih evkariontih pa se proces navadno na tej stopnji še ne ustavi. Struktura kapa-0 preide še eno ali pa največ dve metilaciji. Če se metilira mesto 2’-O na riboznem delu prvega nukleotida (tj. naslednji nukleotid od iniciacijskega), potem taki strukturi pravimo kapa-1. Če pa se metilirata mesti 2'-O na riboznem delu prvega in drugega nukleotida, taki strukturi pravimo kapa-2. Proces metilacije omogoči encim 2'-O-metiltransferaza (2'-O-MTaza). Tako encim 2'-O-MTaza kot N7-MTaza katalizirata prenos metilne skupine z metilnega donorja S-adenozil-L-metionina (SAM). Stranski produkt teh dveh kataliziranih reakcij je S-adenozil-L-homocistein (SAH).

Kaj je vloga različnih kap? Kapa-0 prepreči, da bi 5'-konec verige mRNA sprožil imunski odziv gostiteljske celice in igra pomembno vlogo pri replikaciji virusnega genoma, saj izboljša translacijo virusnih mRNA. Kapa-1 omogoči, da imunski sistem ne more prepoznati molekule mRNA. Vloga kape-2 trenutno ni znana.

Kape pri RNA virusih

Virusi, ki okužijo evkariontske celice, so razvili različne strategije tvorbe kap lastnih molekul mRNA. DNA virusi in retrovirusi se podvajajo v jedru in pri tvorjenju kape-0 izkoristijo molekule gostiteljske celice. Številni virusi, ki se podvajajo v citoplazmi in nimajo dostopa do molekul, potrebnih za dodajanje kape, so v svoj genom vgradili zapise za lastne aparate dodajanja kap. Čeprav sta molekulska organizacija in biokemijski mehanizem tvorjenja kape v virusih različna, so si končne strukture kap podobne.

Negativno usmerjeni RNA virusi iz družin Bunyaviridae in Orthomyxoviridae so razvili edinstven cap-snatching mehanizem. Ta omogoča prevzem kap gostiteljskim molekulam mRNA. Mehanizem deluje tako, da virusna od RNA odvisna RNA polimeraza (RdRp) preko podenote PB2 veže 5’-konec gostiteljske mRNA, ki že ima kapo. Polimeraza RdRp pa ima tudi endonukleazno aktivnost, ki ji omogoči, da odcepi kratek del verige mRNA, na katerem je kapa. Odcepljen košček verige, ki na 5'-koncu vsebuje kapo, deluje kot primer (ang. primer) za virusno polimerazo RdRp. Tako lahko poteče transkripcija virusnega zapisa, kjer je matrična veriga negativna virusna RNA. RdRp sintetizira komplementarno negativno verigo.

Razlika med mehanizmom pri alfavirusih in konvencionalnim mehanizmom je ta, da se GTP metilira na mestu N7 še preden se prenese na iniciacijski nukleotid, ki mu je bil γ-fosfat že odstranjen.

Za virus vezikularnega stomatitisa (VSV) predvidevajo, da se monofosforiliran 5’-konec mRNA verige veže na GDP. Proces naj bi deloval tako, da GTPazna aktivnost v RdRp povzroči nastanek GDP iz GTP. Ta GDP ostane vezan v RdRp in bo deloval kot akceptor mRNA. Med transkripcijo nascentni transkript interagira z aktivnim mestom poliribonukleotidiltransferazne domene, ki se nahaja v RdRp. Posledica interakcije je odcep PPi in nastanek 5’-monofosforiliranega konca verige mRNA, ki se še vedno drži RdRp. Aktivnost poliribonukleotidiltransferazne domene omogoči prenos verige mRNA na GDP. Tako nastane kapa na verigi mRNA. Nato se veriga enako metilira kot pri konvencionalnem mehanizmu.