Virusi, ki jih uporabljamo pri genskem zdravljenju

Gensko zdravljenje

Gensko zdravljenje je metoda, pri kateri z vnosom dednega materiala v celico uravnavamo ali modificiramo ekspresije genov. Glavni področji, kjer se gensko zdravljenje lahko aplicira, sta zdravljenje bolezni, ki so posledica genskih okvar, in zdravljenje rakavih obolenj. Gensko zdravljenje je tesno povezano z uporabo virusnih vektorjev zaradi njihove zmožnosti vstopa in vnosa dednega materiala v gostiteljsko celico. Možna sta dva načina vnosa virusnih vektorjev v celico, to sta in vivo ter ex vivo. Pri metodi in vivo virusne vektorje dovedemo lokalo ali preko sistemske cirkulacije, pri metodi ex vivo pa celice, ki jih želimo transducirati, izoliramo in jih po transdukciji vstavimo nazaj v organizem.

Idealen virusni vektor

Idealen virusni vektor naj bi omogočal možnost prenosa čim večjega odseka DNA, pri čemer bi bila stopnja transdukcije čim višja, zaželena je tudi selektivnost za določen tip celic. Za dolgotrajno uspešnost zdravljenja je potrebno, da se vstavljeni gen izraža v zadostni meri tudi več let po transdukciji. Za zagotovitev varnega genskega zdravljenja virusni vektor ne sme sprožiti imunskega odziva ter ne sme biti zmožen virusne replikacije. Ena izmed nevarnosti je tudi insercijska mutageneza, ki je posledica integracije virusne DNA v gostiteljski genom in lahko vodi v pretirano proliferacijo celic. Ker v naravi ne obstaja virus, ki bi zadostil vsem tem zahtevam, je potrebno obstoječe viruse modificirati do te mere, da bodo ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri tem se najpogosteje uporabljajo adenovirusi, AAV (adeno associated viruses), gamaretrovirusi, lentivirusi in herpesvirusi.

Adenovirusni vektorji

Adenovirusni (Ad) vektorji so primerni predvsem za transdukcijo nedelečih se celic in vivo. Imajo 36 kb velik linearen dsDNA genom, ki se v jedru gostiteljske celice nahaja v obliki episoma, zaradi česar je podvržen procesom utišanja, pa tudi podvojuje se ne. Vnos vektorja je zato potrebno ponavljati. Prednost Ad-vektorjev je relativno enostavna in hitra namnožitev, glavna slabost pa je njihova patogenost, ki se ji je potrebno izogniti.

Priprava vektorjev

Adenovirusni genom vsebuje ti. zgodnje (E, early) in pozne gene. Najprej se prepiše regija E1, ki kodira za dva nujno potrebna proteina za virusno razmnoževanje: E1A, ki spodbuja prepis ostalih genov zgodnje faze, in E1B, ki zavira p53 in s tem preprečuje sprožitev apoptoze, preden bi nastali virioni. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, kar omogoča konstrukcijo varnih vektorjev za gensko zdravljenje. Priprava konstruktov poteka v celični liniji, katere genom regijo E1 vsebuje (npr. HEK293).

Prva generacija Ad-vektorjev je v izogib imunogenosti vsebovala še delecijo regije E3 (ki za replikacijo sicer ni obvezna); vključiti je bilo mogoče do 8,2 kb DNA. Ker je prepis ostalih virusnih proteinov v manjši meri vseeno možen, vektorji zaradi proženja imunskega odziva niso bili učinkoviti. Druga generacija Ad-vektorjev vsebuje dodatno delecijo E2 ali E4. Insercijska kapaciteta znaša do 14 kb.

Najbolj izpopolnjena generacija Ad-vektorjev ima izbrisane vse virusne gene, tako zgodnje kot pozne (katerih produkt so strukturni proteini). Konstrukt vsebuje le signalno regijo za pakiranje (Ψ) in obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR). Razmnoževanje poteka ob pomoči pomožnega vektorja z delecijo E1, ki zagotavlja sintezo proteinov kapside. Na obeh koncih regije Ψ vsebuje pomožni vektor sekvenco loxP, zaradi česar se regija ob prisotnosti rekombinaze Cre (ki jo tudi mora izražati E1-celična linija), odstrani – virioni naj namreč vsebujejo le genom s transgenom. Ti Ad-vektorji so se izkazali za varne in vivo; omogočajo tudi vstavitev do kar 37 kb tuje DNA.

Tkivna specifičnost

Zahtevnejši del zdravljenja z Ad-vektorji je varna dostava do željenega tkiva. Adenovirusi se glede na serotip vežejo na različne receptorje epitelnih celic, ki se izražajo precej tkivno nespecifično. Interagirajo tudi s koagulacijskim faktorjem X, ki povzroči vezavo vektorja na hepatocite – le-te prestrežejo kar 80 % virusnih delcev iz sistemskega obtoka.

Učinkovitejše usmerjanje je moč doseči z modifikacijami proteinov kapside, npr. z genetsko zamenjavo domen, ključnih za interakcije z receptorjem. Najprimernejša je uporaba homolognih domen serotipov iste družine, saj večja sorodnost pomeni manjše tveganje za porušitev stabilnosti kapside. Specifični ligandi so lahko vgrajeni tudi v prokariontske viruse, katerih stopnja transdukcije sesalskih celic je sicer nizka.

Uporaba nekovalentno vezanih adapterjev omogoča modifikacijo virusov, katerih struktura ni natančno znana. Na eni strani se adapter veže na ključno mesto virusnega proteina, na drugi strani pa na izbrani tkivno specifičen receptor. Ker obstaja nevarnost disociacije adapterja, je ta način uporaben za predklinične raziskave.

Bolj varna je kovalentna vezava adapterjev, npr. polietilenglikolnih (PEG) polimerov z vezanim ligandom. Plašč iz PEG deluje tudi kot zaščita pred celicami imunskega sistema in preprečuje vezavo vektorja na hepatocite.

Primer uporabe

V rakavih celicah se Ad-vektor zaradi motenega izražanja p53 lahko razmnožuje. Pride do celične lize, novi virusni delci okužijo sosednje rakave celice. Gendicin, ki je bil na Kitajskem uradno odobren leta 2003 in se uporablja za zdravljenje raka epitelnih celic vratu oz. glave, vsebuje gen za p53. Aktivno prepisovanje tega faktorja poveča stopnjo apoptoze, odstranjevanje tumorja pa dodatno pospešijo celice imunskega sistema, katerih odziv je v tem primeru zaželen. Gensko zdravljenje se uporablja v kombinaciji s kemo- in radioterapijo.

Vektorji z adenovirusi povezanih virusov (AAV)

AAV so virusi z ssDNA genomom dolžine 4,7 kb. Za replikacijo potrebujejo pomožni (adeno)virus, okužijo pa deleče ali nedeleče se celice. Za in vivo uporabo so primerni, ker so za človeka nepatogeni, imajo pa manjšo kapaciteto za vstavitev tuje DNA (do 5,2 kb). Prav tako je zahtevnejša priprava vektorjev za gensko terapijo.

Rekombinantni AAV-vektor vsebuje le obrnjeni terminalni ponovitvi (ITR), medtem ko sta regiji rep in cap izbrisani. Zaradi modifikacij do integracije v gostiteljski genom ne pride, so pa episomalne konkatemere precej stabilne in se lahko izražajo še več let. Namnožitev AAV-vektorjev ob pomoči pomožnega vektorja z regijama rep in cap poteka v E1-celični liniji, za tkivno specifično usmerjanje pa so potrebne modifikacije kapside (ki je v primerjavi s kapsido adenovirusov precej enostavnejša).

Leta 2012 je bila v Evropi in ZDA odobrena Glybera, AAV-vektor z genom za lipoprotein lipazo. Ker je okvara tega gena izredno redka, zdravljenje pa predrago, je bila oktobra 2017 s trga umaknjena.

Decembra 2017 je FDA odobrila Luxturno: subretinalni vnos gena za retinoid izomerohidrolazo omili slepoto pri dedni mrežnični distrofiji.

Retrovirusni in lentivirusni vektorji

Retrovirusi se od AdV in AAV ločijo po tem, da je njihov genom v obliki molekule RNA, poleg tega pa so virioni obdani z lipidno ovojnico. Zmožnost vgradnje virusne DNA v gostiteljski genom daje retrovirusom velik potencial za uporabo v genskem zdravljenju. Integracija gena v genom omogoča, da se tudi ta med celično delitvijo podvoji, zaradi česar so retrovirusni vektorji primerni za transdukcijo delečih se celic (npr. hematopoetske celice). Ostale prednosti so nizka imunogenost, širok celični tropizem in zmožnost vnosa gena velikosti 8–9 kb. Ker regija LTR (long terminal repeat) virusnega genoma vsebuje močan ojačevalec in promotor, lahko v primeru, da se virusna DNA integrira v bližini protoonkogenov, pride do nekontrolirane proliferacije celic. To je tudi glavna pomanjkljivost retrovirusnih vektorjev, ki močno omejuje njihovo uporabo v medicini.

Prvotno so se pri genskem zdravljenju največ uporabljali gamaretrovirusni vektorji, v zadnjem času pa jih izpodrivajo lentivirusni vektorji (najpogosteje se uporablja virus HIV), saj so ti sposobni transdukcije tudi nedelečih se celic, poleg tega pa imajo tudi nižjo stopnjo insercijske mutageneze.

Priprava vektorjev

Lentivirusni vektorji so dandanes modificirani do te stopnje, da imajo odstranjene skoraj vse virusne elemente, s čimer je onemogočena virusna replikacija v organizmu, hkrati je zmanjšana možnost insercijske mutageneze. Ohranjena sta le element ψ, ki je udeležen pri pakiranju genoma v virionski delec in element RRE (Rev response element), ki sodeluje pri od Rev-odvisnem transportu virusne mRNA iz jedra. Znotraj regij LTR je izbrisana regija U3, s čimer sta ti regiji inaktivirani, kar zmanjša možnost insercijske mutageneze. Ugotovljeno je bilo, da pomožni geni (nef, vpr, vif in vpu) za replikacijo virusa in vitro niso nujno potrebni, zato so bili odstranjeni. Z inaktivacijo regije LTR tudi protein Tat ni več potreben. Edini nujno potrebni geni za tvorbo lentivirusnega vektorja so gag, pol, env in rev. Ker so ti geni potrebni le za nastanek viriona, ne pa tudi za samo transdukcijo in integracijo, so zapisani na pomožnih vektorjih, ki so skupaj z vektorjem, ki vsebuje gen za željeni protein in nujne elemente virusne DNA, vstavljeni v celično linijo primerno za tvorbo lentivirusnih vektorjev.

Tkivna specifičnost

Glikoproteini virusne ovojnice določajo celično specifičnost lentivirusnih vektorjev. Ker glikoproteini virusa HIV ne omogočajo široke uporabe pri transdukciji različnih tipov celic, je gen env virusa HIV zamenjan z genom za glikoprotein G virusa vezikularnega stomatitisa, ki omogoča skoraj univerzalno transdukcijo celic. V primeru, da je potrebna večja specifičnost, se lahko uporabi glikoprotein katerega drugega virusa ali pa z rekombinantno tehnologijo ustvarimo fuzijski protein, pri čemer glikoprotein spojimo z ligandom, ki se bo vezal na tarčni protein na površini celic, ki jih želimo transducirati.

Primer uporabe

Avgusta 2017 je bilo v ZDA odobreno prvo zdravilo, ki temelji na uporabi lentivirusnih vektorjev. Zdravilo tisagenlecleucel se uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastne levkemije. Pri zdravljenju s pomočjo lentivirusnega vektorja (HIV-1) v limfocite T vnesejo gen za protitelo proti antigenu CD19, ki se pretirano izraža na površini malignih celic. Transdukcija celic poteka ex vivo.

Viri

[1] K.B. Kaufmann, H. Bu, A. Galy, A. Schambach, M. Grez, Gene therapy on the move, (2013) 1642–1661. doi:10.1002/emmm.201202287.

[2] C. Capasso, M. Garofalo, M. Hirvinen, V. Cerullo, The evolution of adenoviral vectors through genetic and chemical surface modifications, Viruses. 6 (2014) 832–855. doi:10.3390/v6020832.

[3] R. Waehler, S.J. Russell, D.T. Curiel, Engineering targeted viral vectors for gene therapy, 8 (2007) 573–587. doi:10.1038/nrg2141.

[4] L. Vannucci, M. Lai, F. Chiuppesi, L. Ceccherini-nelli, M. Pistello, Viral vectors : a look back and ahead on gene transfer technology, (2013) 1–22.

[5] D. Escors, K. Breckpot, Lentiviral Vectors in Gene Therapy : Their Current Status and Future Potential, (2010) 107–119. doi:10.1007/s00005-010-0063-4.