Razvoj robustnega sistema genetskega biozadrževanja kvasovk s stikalom za stabilnost proteinov

Povzeto po: Engineering stringent genetic biocontainment of yeast with a protein stability switch

Uvod

Ob vse večjih možnostih manipulacije z genomom vseh vrst organizmov, in hkratnemu strmemu padcu cene za to potrebnih orodij, področje sintezne biologije ponuja odgovore na vse več problemov, s katerimi se človeštvo sooča [1]. Kot pri vseh razvijujočih se tehnologijah pa je potrebno tudi na tem podoročju poskrbeti za varnostne protokole in postopke za minimizacijo tveganja.

Eden izmed glavnih faktorjev zagotavljanja varnosti ko pride do mikroorganizmov je biozadrževanje [2]. Sprememba laboratorijskih mikroorganizmov na tak način, da v naravi niso sposobni preživetja je ključna za zmanjšanje tveganja vnosa gensko spremenjenih mikroorganizmov v naravo. To lahko dosežemo na več načinov, najpogosteje z ustvarjanjem auxotrofičnih organizmov preko izbijanja genov, potrebnih za sintezo ključnih metabolitov, ali pa s kontrolo preko samomorilskih genov. Oba pristopa imata svoje probleme, auxotrofični organizmi lahko potrebne metabolite najdejo tudi v določenih naravnih okoljih, pri samomorilskih genih pa evulucijski pritisk pogosto vodi do mutacije na teh genih in njihove posledične inaktivacije [1],[2]. Tretji pristop se osredotoči na pozitivno kontrolo esencialnih genov preko pogojevanja njihovega prepisovanja ali stabilnosti s pogoji prisotnimi le v željenih okoljih [1],[2]. Članek se osredotoči na kontrolo stabilnosti esencialnh proteinov preko uvedbe oznake destabilizacijske domene, ki pa jo stabilizira prisotnost estradiola (ERdd – angl. destabilizing domain degron stabilized by estradiol addition).

Pregledovanje knjižnice za potencialne kandidate

Raziskovalci so najprej preverili vpiv destabilizacije ERdd na GFP z gojenjem kultur kvasovk S. Cerevisiae v prisotnosti in odsotnosti estradiola. V mediju brez estradiola je bila fluorescenca manjša za 95 %, celice v mediju z dodanim estradiolom pa v primerjavi s celicami brez ERdd oznake dosežejo 70 % fluorescence [2]. To nakazuje na možnost uporabe te oznake za namen kontrole stabilnosti esencialnih proteinov.

V nadaljevanju so raziskovalci uporabljali knjižnico kvasovk s proteini, označenimi z GFP (angl. yeast GFP collection), pri katerem je v posameznem sevu po en protein označen z GFP (knjižnica vsebuje 4159 sevov), za njim pa se nahaja še selekcijski marker HIS3MX6. Na podlagi te stalne regije so s pomočjo CRISPR/Cas9 sistema na koncu zapisa za GFP dodali oznako ERdd, hkrati pa zamenjali selekcijski marker HIS3MX6 za LEU2, kar je omogočalo lažjo selekcijo celic, ki so sprejele vnos. Spremenili so 94 % sevov z označenimi proteini, ki se v S. Cerevisiae štejejo med esencialne [2].

Spremenjene seve so nanesli na plošče z in brez dodanega estradiola in identificirali tiste proteine, pri katerih je bila razlika v rasti najbolj izrazita. Za večino proteinov opazne razlike v rasti ni bilo, ta je bila opazna le v 5 % primerov. Za nadaljnje poskuse so izbrali 46 sevov, ki so jih nato gojili še v tekočih kulturah z in brez estradiola ter jim odčitavali optično gostoto. Pri večini sevov niso opazili stroge odvisnosti rasti od prisotnosti estradiola, analize fluorescence in nivoja izražanja GFP pa so potrdile, da se označeni proteini ob odsotnosti estradiola razgrajajo (47-84 % po 24 urah brez estradiola). Zaključili so, da je za večino esencialnih proteinov ostala nerazgrajena zadostna količina za rast [2].

V nadaljevanju so izbrali 6 genov (SEC18, SES1, SPC110, SEC14, RRP46 in DIS3), katerih sevi so pri prejšnjem poskusu pokazali največjo razliko v rasti, in jim v sevu BY4742 neosredno pripeli oznako ERdd, brez uporabe markerskega proteina. Vseh 6 tako nastalih sevov je bilo za rast odvisnih od estradiola. Njihovo rast v prisotnosti estradiola so primerjali še z nespremenjenm sevom BY4742, in na podlagi slabše rasti v primerjavi z njim izločili 3 seve. Če namreč kontrolni sistem povzroča slabšo rast seva od divjega tipa to ustvari evolucijski pritisk v smer inaktivacije le tega. Za nadaljnje raziskave so zato vzeli le seve, ki niso v prisotnosti estradiola kazali nobene razlike rasti v primerjavi s starševskim sevom. To so bili sevi SPC110-ERdd, RRP46-ERdd in DIS3-ERdd. Še posebej ugoden je bil sev SPC110-ERdd, ki je imel v pogojih brez estradiola močno inhibirano rast, že 100 nM koncentracija pa je zadoščala za popolno obnovitev rasti [2].

Po identifikaciji teh treh potenicalnih genov so pripravili še seve s kombinacijami dveh ERdd označenih genov. Vse kombinacije so bile strogo odvisne od prisotnosti estradiola, po njegovem odvzemu so se še nekajkrat delile, nato pa se je rast popolnoma ustavila. To sicer ni veljalo za vse seve z le enim označenim genom, saj sta seva RRP46-ERdd in DIS3-ERdd še vedno rasla v pogojih brez estradiola, četudi počasi [2].

Določevanje frekvence pobega

Kljub temu, da so uspešno pripravili nalezljiv virus IAV, pa je bil končni proizveden titer sorazmeroma majhen. Da bi bolje razumeli dejavnike, ki omejujejo učinkovitost pakiranja virusa v celični liniji, so opravili analizo transkriptoma na celicah iMD, transfeciranih s pDZ-HA in pDZ-NA ter induciranih z doksiciklinom in mifepristonom. Podatke so analizirali s predhodno narejenim programom InVERT, ki kvantificira protismerno vRNA, smerno cRNA in mRNA, ki jo proizvede IAV lastna RdRP [2].

Ugotovili so, da je indukcija močno povišala količino vseh nastalih molekul RNA. Prisotnost posameznih molekul RNA pa je bila vseeno znatno manjša kot pri okužbi celic z IAV. V najmanjši meri so bile prisotne vRNA molekule, kar lahko predstavlja ozko grlo pri sintezi IAV. Da so potrdili to hipotezo so ocenili učinek povečanja proizvodnje IAV v celicah iMD s prekomernim izražanjem vRNA molekul z zapisom za PA, NP, M in NS. Celice so kotransfecirali s plazmidi, ki so imeli zapis za prej omenjene gene in opazili približno 10^2-kratno povečanje titra virusa PR8, kar nakazuje, da potencialno zvišanje ravni vRNA teh genov poveča število nastalih virusnih delcev [2].

Odziv celic iMD na prisotnost virusa

Okužba z IAV v gostiteljskih celicah sproži številne odzive, kot so zaustavitev transkripcije in translacije, vnetne reakcije in protivirusne odzive. V primeru iMD celic virusni material nastaja endogeno, za razliko od klasične eksogene okužbe z virusom. Odziv celic so raziskali tako, da so preučili transkriptom iMD celic 48 ur po transfekciji z pDZ-HA in pDZ-NA in po indukciji. Ugotovili so, da se transkriptom takšnih celic močno razlikuje od neinduciranih in netransfeciranih in tudi navadnih gostiteljskih celic [2].

Opazili so, da je bila, glede na HEK293T celice, prisotna povečana koncentracija genov za boj proti virusom že pred indukcijo, nekateri geni pa so se začeli povečano izražati šele po indukciji. Med geni, ki so bili prisotni v višjih koncentracijah, je bil DDX58 (RIG-I), receptor prirojenega imunskega sistema. Le-ta zazna v citoplazmi prisotno virusno RNA in sproži nadaljnje signalne poti, med njimi tudi sintezo IFNjev in provnetnih citokinov. Drugi geni so tudi IRF7, IFITM1, ISG20 in OAS3. Povečanje izražanja genov je verjetno posledica konstitutivnega izražanja vRNA in potencialno tudi puščanja promotorja za RdRP. Povečano izražanje teh genov okrepi obrambo celic pred virusom in negativno vpliva na proizvodnjo IAV. Nadalje bi lahko naredili celično linijo z izbitimi protivnetnimi virusi ali pa bi zmanjšali izražanje teh genov in znižali raven puščanja promotorja integriranih virusnih elementov [2].

Zaključek

V študiji so uspešno izdelali dokazno celično linijo, ki je zmožna proizvajati nalezljive IAV z nadzorovanim izražanjem vseh virusnih komponent. Sintetična celična linija odstrani potrebo po predhodni kotransfekciji velikega števila plazmidov za generiranje nalezljivih virusov. Analiza transkriptoma celičnih linij je prikazala ozka grla, ki jih lahko ciljamo za izboljšanje proizvodnje IAV, med njimi tudi nizke koncentracije vRNA in povečano koncentracijo protivirusnih genov. S prikazom izvedljivosti razvoja celične linije za pakiranje IAV je ta študija razkrila številne možnosti za optimizacijo tega sintetičnega sistema in njegove morebitne uporabe v industriji cepiv.

Literatura

1. Influenza A Virus and Acetylation: The Picture Is Becoming Clearer - PMC. [cited 28 Mar 2024]. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10820114/

2. Phan T, Ye Q, Stach C, Lin Y-C, Cao H, Bowen A, et al. Synthetic Cell Lines for Inducible Packaging of Influenza A Virus. ACS Synth Biol. 2024;13: 546–557. doi:10.1021/acssynbio.3c00526

3. Das AT, Tenenbaum L, Berkhout B. Tet-On Systems For Doxycycline-inducible Gene Expression. Curr Gene Ther. 2016;16: 156–167. doi:10.2174/1566523216666160524144041

4. Rutigliano JA, Sharma S, Morris MY, Oguin TH, McClaren JL, Doherty PC, et al. Highly Pathological Influenza A Virus Infection Is Associated with Augmented Expression of PD-1 by Functionally Compromised Virus-Specific CD8+ T Cells. J Virol. 2014;88: 1636–1651. doi:10.1128/JVI.02851-13