Vloga malih nekodirajočih RNA pri regulaciji RNA metabolizma rastlin

Uvod

Male RNA (sRNA) so 20 – 31 nukleotidov dolge nekodirajoče molekule RNA, ki na različne načine sodelujejo pri regulaciji izražanja genov. Med te, ki imajo regulacijsko vlogo, najpogosteje prištevamo mikroRNA (miRNA), malo interferenčno RNA (siRNA) in PIWI-interagirajoča RNA (piRNA). Njihova glavna vloga v celici je RNA-interferenca (RNAi) oziroma RNA-vodeno utišanje genov, ki lahko poteka na več nivojih, in sicer transkripcijsko z epigenetskimi modifikacijami, post-transkripcijsko z razgradnjo mRNA in s translacijsko represijo. Pri vseh sodelujejo še AGO proteini, ki vežejo sRNA in skupaj z njimi tvorijo RISC kompleks (RNA-induciran kompleks za utišanje genov). V nadaljevanju se osredotočamo predvsem na pomen RNA-interference pri rastlinah, pri katerih sodeluje pri prilagoditvenih odzivih na spremembe v okolju in pomembnih razvojnih stopnjah, ter na njeno povezavo z retrogradno signalizacijo.

Sinteza malih RNA pri rastlinah

Sinteza miRNA se začne, ko RNA-polimeraza II prepiše gen za miRNA in nastane pri-miRNA, več kot 1000 nukleotidov dolga lasnična RNA molekula, ki še vsebuje 3' poli-A rep in 5' kapo. Nanjo deluje DCL1 (encim z endonukleazno aktivnostjo), kar vodi v nastanek pre-miRNA, 70 nukleotidov dolgo lasnično RNA. Sledi vezava kompleksa DCL1/3/4 s pomožnimi proteini HYL1, SE in TGH, kar vodi v nastanek dvoverižnega dupleksa z vodilno in tako imenovano »passenger« verigo. Na obeh 3' koncih se nahaja dva nukleotida dolg privesek, ki ga v citoplazmi metilira metiltransferaza HUA ENHANCER1 in s tem zavaruje molekulo pred uridilizacijo ter razgradnjo. Na koncu se miRNA dupleks s pomočjo šaperonov naloži na AGO1/10 in tvori aktiven miRISC kompleks, pri čemer v kompleksu ostane le vodilna veriga.

Za razliko od miRNA se siRNA ne prepiše iz lastnega gena, ampak se njena sinteza v celici prične, ko RNA polimeraza IV prepiše transpozone in ponavljajoče se regije. Primarni transkript ni podvržen DCL proteinom, ampak se najprej s pomočjo RNA-odvisne RNA polimeraze RDR2/4 podvoji, da nastane dvoverižna RNA. Šele takrat se prenese v citoplazmo, kjer jo DCL2/3/4 razreže na 20 – 24 nukleotidov dolge fragmente, ki se s pomočjo šeperona HSP90 naložijo na AGO4/6/9 in tvorijo siRISC kompleks.

Transkripcijsko utišanje genov

RNA-interferenca na ravni transkripcije poteka na osnovi epigenetskih modifikacij histonov in DNA. Gre predvsem za metilacije cisteinov in lizinskih aminokislinskih ostankov na histonih, kar vodi v nastanek heterokromatina, ki je prepisno neaktiven.

Metilacija histonov

Glavno vlogo pri sRNA vodeni metilaciji histonov ima kompleks za RNA-inducirano transkripcijsko utišanje genov – RITSC, ki ga sestavljata AGO1 z vezano siRNA, ki se med elongacijsko fazo transkripcije komplementarno veže na primarni transkript mRNA, ter Chp1, ki se s kromatin-vezavno domeno veže na histonsko modifikacijo H3K9me. Ko je RITSC enkrat močno vezan, lahko interagira s kompleksom CLRC, ki med drugim vsebuje tudi encim z metiltransferazno aktivnostjo – ta katalizira nadaljno metilacijo histonskega lizina. Na metilirano mesto se še dodatno veže Swi6, homolog heterokromatinskega proteina 1 (HP1), ki še dodatno stabilizira strukturo heterokromatina. Transkripcija se zaključi z disociacijo RNA-polimeraze, ki jo na neznan način katalizira RITSC.

Metilacija DNA

RNA-odvisen DNA metilacijski kompleks sestavljata siRNA v kompleksu z AGO4 in metiltransferaza DRM2, ki ima katalitično vlogo. Do vezave na primarni transkript pride zaradi komplementarnosti s siRNA, medtem ko za stabilizacijo in organizacijo kompleksa skrbita KTF1, ki kompleks povezuje tako z RNA-polimerazo kot s predhodno prisotnim 5-metilcitozinom na DNA, in RDM1, ki kompleks povezuje z metiltransferazo DRM2. Za uspešeno utišanje je potreben še katalitično neaktiven DRM3, ki pripomore k usmerjanju in stabilizaciji DRM2.